ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: AVALIAÇÃO DO ÓLEO DE SEMENTE DE Michelia champaca NA PRODUÇÃO DE LIPASE POR Botryosphaeria ribis EC-01
AUTORES: PIACENTINI, T.P. (UEL) ; GONÇALVES, A.M. (UEL) ; ANDRADE, M.M (UEL) ; DALL'ANTONIA, L.H (UEL) ; DEKKER, R.F.H (BRI) ; BARBOSA, A.M. (BRI) ; FARIAS, T.J. (UEL)
RESUMO: A semente de Michelia champaca é constituída por ésteres de ácido graxo e constitui uma fonte atrativa para a produção de biodiesel. Neste trabalho o óleo da semente de M. champaca foi extraído a frio com hexano e também em Soxhlet com éter de petróleo, tendo sido obtido, neste último, maior rendimento (31,57%). O óleo foi utilizado a 1% (v/v) como fonte de carbono no meio mínimo de Vogel para o fungo Botryosphaeria ribis sob fermentação submersa a 180 rpm durante 120h a 28 ºC. Foram obtidos altos títulos de lipase (53,32 U/mL), cuja atividade ótima foi obtida em pH 8 e 55ºC. A lipase foi estável entre 30 e 55ºC em pH de 5 a 10, e apresentou tolerância de 50, 25 e 10% (v/v) em glicerol, metanol e etanol, respectivamente.
PALAVRAS CHAVES: óleo de semente de michelia champaca, lipase, botryosphaeria ribis
INTRODUÇÃO: A Michelia champaca pertence à família de plantas Magnoliaceae, que consiste de aproximadamente nove gêneros e 70 espécies (HOSAMANI et al., 2009). O óleo da semente de M. champaca por apresentar importantes ésteres de ácido graxo constitui uma fonte alternativa para a produção de biodiesel. Não existem relatos do uso do óleo da semente de M. champaca como fonte de carbono para a produção de lipases. As lipases (E.C.3.1.1.3) são definidas como carboxilesterases que hidrolisam acilgliceróis de cadeia longa, liberando monoglicerídeos, diglicerídeos, ácidos graxos livres e glicerol na interface óleo-água (VERGER, 1997; JAEGER; DIJKSTRA; REETZ, 1999; GHALY et al., 2010; SHARMA et al., 2011). São amplamente distribuídas na natureza, sendo produzidas por plantas, animais e micro-organismos. Porém, somente as produzidas por fungos e bactérias estão disponíveis comercialmente. Os fungos são especialmente valorizados por produzirem enzimas extracelulares, o que facilita a recuperação do meio de fermentação. Vários fungos de diferentes gêneros têm sido relatados como bons produtores de lipases, entre eles se destaca o Botryosphaeria ribis (MESSIAS et al., 2009). Neste trabalho o óleo da semente de Michelia champaca foi extraído por dois processos diferentes e utilizado como fonte de carbono para produzir lipase extracelular pelo Botryosphaeria ribis EC-01. Algumas propriedades desta enzima também foram caracterizadas para futura aplicação na produção de biodiesel.
MATERIAL E MÉTODOS: Para a extração do óleo, as sementes da espécie vegetal foram secadas à temperatura ambiente por dois dias e, em seguida, em estufa a 45oC por mais 5 dias. O material seco foi triturado em liquidificador e o pó resultante foi extraído exaustivamente com hexano à temperatura ambiente e também por Soxhlet com éter de petróleo. A mistura foi, então, filtrada e o solvente do filtrado contendo o óleo extraído foi destilado em evaporador rotativo. A lipase de B. ribis foi produzida e preparada de acordo com Messias et al. (2009), substituindo-se a fonte de carbono por 1% do óleo da semente de M. champaca. A atividade de lipase foi determinada pelo método do p-NPP (palmitato de p-nitrofenila), nas condições otimizadas por Messias et al.(2009). O pH ótimo da lipase foi determinado incubando-se a enzima em diferentes tampões e valores de pH ( KCl / HCl: 1-2, citrato-fosfato; 3-7, fosfato de sódio; 6-8, TRIS / HCl; 8-9, ácido bórico / boráx; 8-9 e glicina / NaOH; 9-10) por 2 min a 30º C. Após a determinação do pH otimo, a lipase foi incubada por 2 min em pH 8,0 (tampão fosfato de sódio 0,05 M ) em temperaturas variando de 30 º a 65 º C, para determinação da temperatura ótima. A estabilidade térmica da lipase foi avaliada nas temperaturas de 30-80ºC, em intervalos de tempo entre 5 min. e 180 min (3h). Para as temperaturas de 30-55ºC, o intervalo considerado foi de 5 min. a 5760 min. (96h). Ensaios de estabilidade, nos tampões acima citados e com solventes orgânicos (acetona, butanol, isopropanol, hexano e tolueno: 99,3% (v/v), glicerol: 50%(v/v), metanol e etanol: 1,2,5,10,25,50,99%(v/v)) foram desenvolvidos incubando a lipase com cada um dos solventes por 1h a 30ºC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A extração do óleo por Soxhlet teve o maior rendimento (31,57 %). Os maiores títulos de lipase obtidos (53,32 ± 6,04 U/mL) foi com 1% (v/v) de óleo da semente de M. champaca como fonte de carbono. O pH ótimo da lipase de B. ribis foi determinado em pH 8,0 utilizando-se o tampão fosfato de sódio e a temperatura foi 55ºC. A lipase reteve 80% de sua atividade inicial nos primeiros 1440 min. (24h) de 30-55 ºC e 70% após 180 min. (3h) a 60ºC (Figura 1). Messias et al. (2009) relataram resultados semelhantes com a lipase deste mesmo fungo, utilizando 1%(v/v) de óleo de soja como fonte de carbono. Mudanças no pH de 1-10 mostraram alguns efeitos na enzima: pH 1-4 cerca de 40% da atividade inicial foi mantida, pH 5-10 de 70% a 80% da atividade inicial foi mantida, exceto para o ácido bórico/bórax pH 8 (65%). Resultados semelhantes foram descritos para a lipase de Penicillium aurantiogriseum (LIMA et al., 2004). Na presença dos solventes (Tabela 1), a enzima se manteve estável em glicerol 50%(v/v), metanol até 25%(v/v) e etanol até 10%(v/v), contrastando com os resultados descritos por Messias et al. (2009) para esta mesma enzima produzida em óleo de soja pelo mesmo fungo, visto que a lipase foi estável em concentrações de até 50%(v/v) de etanol e metanol.
CONCLUSÕES: A lipase de B. ribis produzida em óleo de M. champaca como fonte de carbono apresentou atividade ótima em tampão fosfato pH 8 e 55ºC. Foi estável nas temperaturas de 30 a 55ºC por até 24 h., bem como em glicerol 50% (v/v), metanol até 25% (v/v) e etanol até 10% (v/v), podendo ser utilizada na produção de biodiesel em sua forma livre.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: GHALY, A.E.; DAVE, D.; BROOKS, M.S.; BUDGE, S. Production of biodiesel by enzymatic transesterification: Review. 2010. American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 6: 54-76.
JAEGER, K.E.; DIJKSTRA, B.W.; REETZ, M.T. Bacterial biocatalyst: molecular biology, three dimensional structures and biotechnological applications in lipases. 1999. Annual Review of Microbiology,53: 315-351.
LIMA, V.M.G., KRIEGER, N., MITCHELL, D.A., FONTANA, J.D. 2004. Activity and stability of a crude lipase from Penicillium aurantiogriseum in aqueous media and organic solvents. Biochemical Engineering Journal, 18: 65-71.
MESSIAS J.M., COSTA B.Z., LIMA V.M.G., DEKKER R.F., RESENDE M.I., KRIEGER N., BARBOSA A.M. 2009. Screening Botryosphaeria species for lipases: Production of lipase by Botryosphaeria ribis EC-01 grown on soybean oil and other carbon sources. Enzyme and Microbial Technology, 45: 426-431.
SHARMA, D.; SHARMA, B.; SHUKLA, A.K. 2011. Biotechnological Approach of Microbial Lipase: a Review. Biotecnology,10: 23-40.
VERGER, R. Interfacial activation of lipases: facts and artifacts. 1997. Trends in Biotechnology,15: 32 -38.
