ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: DETERMINAÇÃO DE LIPASE DE ASPERGILLUS SP(CFAM314) EM ÓLEOS COMERCIAIS COM APLICABILIDADE NA PRODUÇÃO DE BIODIESEL
AUTORES: GONÇALVES, B.G (UFSJ) ; ALMEIDA, F.G.O (UFSJ) ; HENRIQUES, F.A.F.A (UFSJ) ; COIMBRA, M.C (UFSJ) ; SANTOS, N.P (UFSJ) ; CARNEIRO, P.G (UFSJ) ; ALEIXO, A.A (UFSJ) ; RESENDE, R.R (UFSJ) ; FERREIRA, J.S (UFSJ) ; CARNEIRO, A.L.B (UFAM) ; FERNANDES, O.C.C (FIOCRUZ MANA) ; SILVA, J.C (FIOCRUZ MANA) ; DA SILVA, S.L (UFSJ)
RESUMO: Neste trabalho foi avaliada a atividade indireta de lipase através de uma nova metodologia utilizando titulação potenciométrica convencional. Quatro óleos comerciais foram testados como fonte de carbono: soja, oliva, milho e girassol. O fungo Aspergillus sp (CFAM 314) apresentou maior produção de ácido graxo, e consequentemente, de expressão de lipase no óleo de milho em 144 horas de crescimento.
PALAVRAS CHAVES: aspergillus sp, lipase, biodiesel
INTRODUÇÃO: Os fungos são produtores de inúmeros metabólitos, dentre estes as enzimas, que se destacam pelo seu alto poder catalítico. As lipases fúngicas são biocatalisadores que hidrolisam triacilgliceróis formando ácidos graxos e glicerol. Condições de crescimento, avaliação de fonte de carbono e nitrogênio, temperatura de incubação, pH, entre outros, podem influenciar a síntese de lipase. Segundo Shelley et al (1987) três fatores devem funcionar juntos para detectar positivamente lipases: 1) o organismo deve produzir; 2) o organismo deve produzir ou liberar lipase nas condições de crescimento prevalecente; e 3) o método de crescimento usado deve ser de sensibilidade suficiente (HASAN et al, 2009). Aspergillus sp são exímios produtores de lipase, tendo papel na indústria farmacêutica, têxtil, alimentícia, e na produção de biodiesel (JAYAPRAKASH et al,2010). A lipase produzida pode ser dosada indiretamente a partir do ácido graxo produzido na hidrólise do triacilglicerol. A medida deste produto pode ser feita a partir de vários métodos, entre eles a titulação (GONÇALVES, 2007). O objetivo desse estudo foi propor uma nova metodologia para determinar indiretamente a produção de lipases de uma espécie de Aspergillus sp (CFAM 314) a partir de uma adaptação de HASAN et al. (2009), através de titulação potenciométrica.
MATERIAL E MÉTODOS: O fungo Aspergillus sp (CFAM314), isolado a partir do solo da Reserva Mamirauá foi cedido pela FIOCRUZ-AM. Para a determinação indireta da atividade lipolítica utilizou-se o meio czapeck sem dextrose, enriquecido de quatro óleos separadamente: milho, soja, oliva e girassol. O preparo do meio consistiu em acertar o pH para 7,3 e emulsificar o óleo com o meio em liquidificador (Mondial) durante um minuto. Foi inoculado 1 milhão de esporos em 70 mL de meios de cultura e estes foram mantidos em estufa a 28°C sob agitação constante de 140 rpm durante seis dias. O micélio foi retirado por filtração a vácuo e ácido graxo produzido pela hidrólise dos óleos foi titulado com solução alcoólica de KOH 0,3M em um titulador potenciométrico (Titrino Plus Metrohn 877) para estimar a atividade lipolítica através do produto de lipólise. A medida foi realizada em triplicata e em intervalos de 24 horas a partir do inóculo durante seis dias. Foram calculados as médias e desvios padrão para cada dia.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: De acordo com os resultados obtidos, foi observado em geral um aumento na produção de ácido graxo com o passar dos dias (Figura 1). A maior produção de ácido graxo foi verificada quando o Aspergillus sp (CFAM 314) foi crescido no meio czapeck enriquecido de óleo de girassol após120 horas, alcançando uma produção de 1,1 mols em 144 horas. Posteriormente o óleo de oliva foi o que apresentou o melhor resultado, com a obtenção de 0,85 mols de ácido graxo no período de 96 horas. Na literatura, o óleo de oliva tem se mostrado como um substrato muito utilizado para métodos titulométricos (HASAN, 2009). Os óleos de soja e milho mantiveram praticamente constante a produção de ácido graxo a partir de 72 horas até 144 horas, com produção em torno de 0,15 mols. A quantificação do produto é uma medida indireta da expressão de lipase. Sendo assim, o óleo de girassol apresentou-se como a fonte de carbono mais adequada para a lipase produzida pela cepa em estudo.
É importante ressaltar que as reações de lipólise permitem que sejam liberados ácidos e, consequentemente, este ácido pode ser quantificado por métodos titulométricos. Entretanto, a técnica mais indicada na literatura para detecção de lipase é o método do pH-stat, na qual a atividade lipolítica é medida em uma emulsão agitada mecanicamente de triacilglicerídeos naturais ou sintéticos pela neutralização dos ácidos graxos liberados com o tempo, adicionando NaOH a fim de manter o pH em um valor constante no ponto final (HASAN, 2009). Entretanto, através da metodologia empregada neste trabalho foi possível estabelecer de maneira indireta e rápida a produção de lipase através do uso de tituladores potenciométricos comuns.
Figura 1. Titulação potenciométrica dos ácidos graxos produzidos pela hidrólise do óleo. Quatro óleos (soja, oliva, milho e girassol) foram testados e titulados a cada 24 horas e a atividade lipolítica é estimada pela formação do produto, no caso o ácido graxo titulado.
CONCLUSÕES: A quantificação indireta da produção de lipase adotada neste trabalho mostrou-se satisfatória, devido a um aumento na produção de ácido graxo, conforme o esperado.Verificou-se que a fonte de carbono pode estimular ou inibir a síntese de lipase, uma vez que os óleos de girassol e oliva apresentaram uma maior produção de lipase comparando-se aos demais óleos testado. Aspergillus sp(CFAM 314) apresentou-se como um potencial produtor lipolítico, contendo as melhores condições para a produção de lipase crescido no meio czapeck com óleo de girassol. Com estas condições; apresentaram-se, portanto, como fonte alternativa para produção dessa enzima e por isso, etapas posteriores de identificação molecular, morfológica,isolamento e caracterização de lipase estão sendo realizadas.
AGRADECIMENTOS: CNPQ, UFSJ. FAPEMIG.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1.BROCKMAN, H. L et al. (1981), Triglyceride lipase from porcine pancreas. Methods Enzimol; 71:619-27.
2.GONÇALVES, F.A.G., 2007. Produção de lipase extracelular por levedura em cultivo submerso. Dissertação de mestrado em Ciências dos Alimentos.
3. HASAN, F.; SHAH, A. A.; HAMEED, A. et al (2009), Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review
4. JAYAPRAKASH, A. et al. (2010), Indian Journal of Science and Technology. 3: .2
5.SHELLEY, A.W. et al. 1987.Journal Microbiology Methodology. 6:123–37.
6. SRIVATHSAN, V. R. et al. (2008), Bioresource Technology.99:.10
