Quantificação de Mercúrio em Fígado de Peixe Filhote (Brachyplathystoma filamentosum) da Região de Porto Velho/Brasil por GFAAS

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Cavalcante Souza Vieira, J. (UNESP) ; Pereira Braga, C. (UNESP) ; Cavecci, B. (UNESP) ; Correia Bitarello, A. (UNESP) ; Queiroz, J.V. (UNESP) ; Magalhães Padilha, P. (UNESP)

Resumo

Avaliação e quantificação do teor de mercúrio presente em amostras de tecido hepático no peixe filhote da área de influência da AHE JIRAU - Bacia do rio Madeira, buscando definir um biomarcador proteico (metaloproteínas, metalotioneínas) para monitoramento deste elemento em peixes. Para realização desta pesquisa, utilizou-se técnicas de proteômica/metalômica: eletroforese bidimensional (2D-PAGE), espectrometria de massas (ESI-MS), espectrometria de absorção atômica (GFAAS) e bioinformática. Por GFAAS foi possível analisar e quantificar o mercúrio presente nos spots proteicos, obtidos no fracionamento das proteínas por 2D-PAGE. Caracterizações das proteínas foram feitas por ESI- MS, podendo assim, fazer uma correlação do mercúrio presente nos spots com as proteínas caracterizadas.

Palavras chaves

biomarcador; GFAAS; mercúrio

Introdução

Introdução O pescado é uma das fontes de proteína mais consumida pela população humana no mundo (MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA, 2013). No peixe, encontramos vários nutrientes dos quais nosso organismo necessita, tais como: ferro, vitamina B12, cálcio, fósforo, iodo, cobalto, fontes de ômega 3, entre outros. Além disso, os pescados são boas fontes de aminoácidos essenciais, que participam da formação de proteínas necessárias para o organismo, e seu consumo está associado com a prevenção de doenças cardiovasculares e neurológicas. No entanto, nas últimas décadas vem crescendo a preocupação com a contaminação dos pescados por metais tóxicos, especialmente em relação ao mercúrio (Hg) que possui alta toxidade. Esse elemento tem a capacidade de se acumular nos tecidos dos seres que compõem os ecossistemas aquáticos e consequentemente em toda a cadeia trófica, aumentando seus níveis nos predadores topo de cadeia (NEVADO et al., 2010). Estudos recentes têm demonstrado que altos níveis de Hg a partir de fontes não- antrópicas também são encontrados em compartimentos abióticos e bióticos em várias regiões da Amazônia. As mudanças ambientais decorrentes da construção e operação de Usinas Hidrelétricas (UHE) podem alterar a dinâmica do Hg na área, liberando espécies mercuriais inicialmente indisponíveis para a biota aquática. Com isso, os peixes bioacumulam esse elemento em seu organismo e repassa a população humana (ASCHNER 2002). Nesse sentido, nosso estudo buscou quantificar o Hg em tecido hepático do peixe filhote, um dos mais consumido pela população de Porto Velho-Ro.

Material e métodos

Material e Métodos O tecido hepático dos peixes coletados foi macerado com nitrogênio líquido (N2), e as proteínas obtidas foram fracionadas através misturas etanol/clorofórmio e etanol/ácido clorídrico, o precipitado foi lavado com etanol gelado e feita a determinação de proteína total através do método de Biureto. Após esses procedimentos, os pellets proteicos foram ressolubilizados em tampão específico e submetidos ao processo de separação por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D –PAGE, gel de 15%). Os spots de massa molar inferior a 30 kDa foram recortados e mineralizados por processo de digestão ácida (sulfúrico/peroxido de hidrogênio 4:1) e o Hg quantificado através de técnica de espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) (MORAES, P. M et al., 2013). As concentrações de Hg encontrada nos spots ficaram entre 12,50 - 83,40 mg g-1 de Hg. Os spots que apresentaram Hg, foram levados para caracterização das proteínas por espectrometria de massa (ESI-MS) com objetivo de identificar possíveis biomarcadores proteicos de Hg.

Resultado e discussão

Resultados e Discussão Foi possível quantificar Hg presente em 10 spots de baixa massa molar (Tabela 1) e caracterizar por ESI-MS 6 proteínas possivelmente ligadas a esse metal potencialmente toxico. Fazendo correlações estequiométricas de átomos de Hg por moléculas de proteínas, foi possível verificar uma correlação significativa entre ambos. O spot 9 apresentou aproximadamente 4 átomos de Hg por moléculas de proteína e o spot 5, cerca de 2 átomos de Hg por moléculas de proteína, além desses spots mostrarem intensidade significativas em todos os géis (Figura 1). As proteínas caracterizadas foram: Glycolipid transfer protein, Ubiquitin -40S ribosomal protein S27a, Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1, Macoilin-2, N-terminal Xaa-Pro-Lys N-methyltransferase 1 e GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein, e demonstraram ser potenciais biomarcadoras desse metal em peixes, pois apresentaram boa intensidade nos spots e grupos com afinidades à metais, principalmente metais divalentes como o Hg.

Estimativa do número de átomos de mercúrio por molécula de spot proteico das amostras de tecido hepático de jaraqui, tucunaré e filhote


Gel de 15% (m/v) obtido por 2D-PAGE (faixa de pH 3- 10) para amostras de tecido hepático de filhote. Os números e círculos em azul indicam os spots nos

Conclusões

Conclusões Nas determinações por GFAAS, somente spots proteicos com massa molar menor que 20 kDa apresentaram mercúrio na faixa de concentração de 12,50 a 83,40 mg g-1. De um total de 10 spots caracterizados, foram identificadas por ESI-MS 6 proteínas que apresentaram características de biomarcadoras deste elemento nas amostras estudadas. Com esses resultados, podemos definir um perfil de biomarcador proteico para o mercúrio nas amostras estudadas.

Agradecimentos

Agradecimentos: Agradeço a FAPESP-2012/24035-5, ESBR PD-6631-0001/2012 e CAPES pelo apoio financeiro para desenvolvimento desse trabalho.

Referências

Referências Bibliográficas
ASCHNER, M. The neuro-toxic mechanisms of fish-borne methylmercury. Environ. Toxicol. Pharmacol., v. 2, p. 101-104, 2002.
Ministério da Pesca e Aquicultura, Disponível em: < http://www.mpa.gov.br/aquiculturampa/informacoes/potencial-brasileiro>. Acesso em: agosto de 2013.
MORAES, P. M.; SANTOS, F. A.; CAVECCI, B.; PADILHA, C. C. F.; VIEIRA, J. C. S.; ROLDAN, P. S.; PADILHA, P. M. GFAAS determination of mercury in muscle samples of fish from Amazon, Brazil. Food Chem., v. 141, p. 2614-2617, 2013.
NEVADO, J. J. B.; MARTÍN-DOIMEADIOS, R. C. R.; BERNARDO, F. J. G.; MORENO, M. J.; HERCULANO, A. M.; NASCIMENTO, J. L. M.; CRESPO-LÓPEZ, M. E. Mercury in the Tapajós River basin, Brazilian Amazon: a review. Environ. Int., v. 36, p. 593-608, 2010.