ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Bezerra, T.M.O. (UFPE) ; Franco, O.L. (UNB) ; Oliveira, M.D.L. (UFPE) ; Oliveira, I.S. (CBPF) ; Andrade, C.A.S. (UFPE)
Resumo
Este trabalho descreve o desenvolvimento de biossensor para detecção de bactérias gram-positivas e gram-negativas. O sistema NPsAuCys-clavA foi utilizado para detecção e reconhecimento das bactérias. A modificação do eletrodo foi avaliada através das técnicas da microbalança de cristal de quartzo. O biossensor demonstrou uma excelente capacidade de detecção representando uma ferramenta valiosa no controle de qualidade de alimentos.
Palavras chaves
NPS - Nanopartículas; clavA - peptídeo; Cys - Cisteína
Introdução
Biossensores são dispositivosanalíticos que utilizam reações biológicas para detecção de analitos (PATHAK et al., 2007, WANG, 2000). Os biossensores são excelentes alternativas para a detecção de bactérias devido a sensibilidade e especificidade para detecção dos microorganismos, além de possuir grande vantagem, pois apresentam rapidez e baixo custo. A microbalança de cristal de quartzo (QCM) é uma técnica cujo propósito é provocar uma oscilação num cristal piezelétrico através de um circuito oscilador, sendo capaz de detectar valores reduzidos de variação de massa. Dentre os materiais mais utilizados na construção de sensores podemos destacar as nanopartículas de ouro(NPsAu) que, devido a facilidade de funcionalização, aumenta a especificidade para a ligação de biomoléculaspermitindo a formação de bioconjugados. Em adição, os peptídeos antimicrobianos mostram-se eficazes na interação com organismos patogênicos sendo, desta forma, alternativasúteis para o desenvolvimento de sensores para bactérias. A clavanina A (Clav A) é uma isoforma do peptídeo antimicrobiano extraído de animais aquáticos que se diferencia das demais clavaninas do grupo por apresentar uma maior atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. A sua atividade antimicrobiana é devido à estrutura catiônica anfipática, a qual interage com lipídios aniônicos predominantes nas membranas dos micro-organismos, seguida pela penetração na membrana (MARTIN, GANZ e LEHRER, 1995, NIJNIK e HANCOCK, 2009). São bactérias que habitam o intestino humano naturalmente, podendo até contribuir para a absorção dos nutrientes, porém quando vai para outras partes do organismo humano pode provocar várias doenças. A contaminação pode ser através de alimentos e da água causando problemas ao ser humano.
Material e métodos
Os cristais de quartzo foram limpos com clorofórmio e, em seguida, lavados exaustivamente com água deionizada e utilizados imediatamente após a limpeza. Na realização dos ensaios os respectivosharmônicos de oscilação do cristal e parâmetros de dissipaçãoforam estabilizados injetando-se água deionizada em fluxo continuo por 5 min. Posteriormente, injetou-se solução aquosa 25mM de L- Cisteína (Cys) em fluxo para modificação química do cristal por 5 min. Após a injeção o fluxo foi desligado e a solução ficou em contato com o cristal por mais 20 min. Em seguida o fluxo de água deionizada foi ligado novamente com objetivo de remover asmoléculas não adsorvidas e foi injetada uma solução recém- preparada de 0.4M de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC) e 0.1M de N-hidroxisuccinimida (NHS)numa proporção de 1:1(v/v). Posteriormente, foi injetada uma solução de nanopartículas de ouro (NPsAu) modificadascomcisteína e a Clav A, os quais ficaram em contato com o cristal por 30 min. Após a obtenção do sistema biossensívelCys-(EDC:NHS)-NPsAu-clavA , o mesmo foi exposto a 100 µL de cada bactéria do tipo E. Coli, K. pneumoniae, B. Subtilis e E.faecalis em diferentes concentrações (10², 10³, 10⁴, 10⁵ e 10⁶ CFU/mL) e após 20 min foi realizada a análise dos valores finais de frequência e resistência em função do tempo. Os ensaios foram realizados em triplicata utilizando, pelo menos, três sensores diferentes.
Resultado e discussão
A adsorção da bactéria resulta em respostas que confirmam oaumento da massa na
superfície do cristal de quartzo, associado à redução da frequência do sensor. Na
primeira etapa de modificação foi adicionada aCyspara a formação da monocamada
automontada resultando na diminuição da frequência devido aadsorção desta
molécula. Em seguida, a adição da solução (EDC:NHS)-NPsAuCys-clavA causa um novo
decremento da frequência. Após 5min o sistema adquire estabilidade e
posteriormente avaliada sua interação com as diferentes bactérias.
Resultado de frequência final nas diferentes concentrações da K. pneumoniae, E.coli, B. subtilis e E.faecalis frente ao sistema sensor
Resultado de resistência final nas diferentes concentrações da K. pneumoniae, E.coli, B. subtilis e E.faecalis frente ao sistema sensor.
Conclusões
No presente trabalho o sistema Cys-NPsAuCys-Clav A foi capaz de detectar/diferenciar as bactérias gram-negativas Escherichia Coli e Klebsiellapneumoniae e gram-positivas BacillusSubtilis.Osistema foi mais sensível na detecção das bactériasBacillusSubtilise EnterococcusFaecalispois, por ser bactérias gram-positivas sua estrutura apresenta uma maior quantidade de lipídios aniônicos em sua membrana, interagindo com a estrutura catiônica presente na clavanina A. O sistema Cys-NPsAuCys-Clavpode ser uma excelente alternativa para o diagnóstico de infecções bacterianas.
Agradecimentos
CNPq, Rede de Nanobiotecnologia/CAPES.
Referências
LI.Y et al. A nanoparticle amplification based quartz crustal microbalance DNA sensor for detection of escherichia coli O157H7. Departament of biological and agricultural al Enginnering the University of Arkansas, 2005.
OLIVEIRA,C.V.J et al. Desenvolvimento de um sensor impedimétrico utilizando peptídeo antimicrobiano para a detecção de bactérias gram-negativas. Departamento de bioquímica, Universidade Federal de Pernambuco.
SAÙDE,A.C.M. O uso da clavaninananoestruturada no controle de sepse polimicrobiana. Universidade Católica de Brasília, 2012.
LIMA,L.A. Prospecção e purificação de peptídeos com atividade antimicrobiana a partir de corais da costa brasileira, Universidade Católica de Brasília, 2012.
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