ISBN 978-85-85905-15-6
Área
Alimentos
Autores
Alves, M.F. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Filho, D.F. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Lima, M.D. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Bauer, L.C. (FAINOR) ; Santana, D.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Fernandes, S.A.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA)
Resumo
Objetivou-se com este trabalho aplicar a metodologia de saponificação a quente do analito para extração do colesterol em composto lácteo, seguido da otimização da metodologia e cálculo do percentual de recuperação. As amostras do composto lácteo foram injetadas num cromatógrafo líquido de alta eficiência. A condição ótima para a extração do colesterol, utilizando a metodologia de saponificação a quente, é de 8 mL de KOH 3% (m/v) em agitação por 1 h,com adição de 4 mL de água e finalizando com lavagem utilizando 12 mL de hexano. Os percentuais de recuperação foram de 125,284%, 128,157% e 125,995% respectivamente para as concentrações de padrão adicionadas de 75µg mL-¹, 150µg mL-¹ e 300µg mL-¹. Portanto, o método foi adequado e poderá ser aplicado após avaliar outros parâmetros de validação.
Palavras chaves
cromatografia; otimização; recuperação
Introdução
O colesterol é uma molécula fundamental para o corpo humano por apresentar diversas funcionalidades no mesmo tais como componente de membrana celular e esqueleto-base para a síntese de hormônios com núcleo esteroidal. Sendo adquirido na alimentação, o corpo necessita de certa quantidade desse composto para a reposição do que foi gasto. São encontradas quantidades consideráveis de colesterol em leite e derivados, assim com o composto lácteo. O composto lácteo é um coproduto que provém da mistura de componentes lácteos e não lácteos, sendo necessária a porcentagem mínima de 51% desses componentes para ser considerado um composto lácteo (BRASIL, p.8, 2007). Por não ser integral, o seu valor aquisitivo é menor e é utilizado como substituto do leite em pó integral na dieta da população. A reação de saponificação (ou hidrólise alcalina) é o método utilizado para a extração do colesterol por basear-se na produção de sabão de ácidos graxos, ou seja, formação de sais de ácidos graxos presentes na matriz, separando o analito que é insaponificável por não possuir ácido graxo na sua estrutura. A reação se dá por meio de uma hidrólise em meio básico entre um álcool e uma matéria graxa. De acordo com Galdámez (p.133, 2002), ao realizar experimentos industriais, é comum se verificar a necessidade de se estudar o efeito de um ou mais fatores de controle ao mesmo tempo. A aplicação das técnicas de planejamentos de experimentos fatoriais fracionados 2k-p, mostra-se como uma das soluções para esse tipo de problema. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o método de extração de colesterol por saponificação a quente em composto lácteo analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Material e métodos
As amostras de composto lácteo em pó foram obtidas no comércio local da cidade de Itapetinga/Ba. As análises foram realizadas no Centro de Estudos e Análises Cromatográficas na Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia–Itapetinga/BA. Para a extração do colesterol a quente pesou-se 0,25 g de amostra em tubo de ensaio, adicionou-se 10 mL de KOH 2% em etanol absoluto. Posteriormente, os tubos foram colocados em banho-maria à 50°C em agitação ultrassônica durante 2 h. Em seguida, adicionou-se 5 mL de água destilada e deixou-se resfriar. Para extração da matéria insaponificável, adicionou-se 10 mL de hexano agitando em vórtex por 1 min. Após a separação, toda a fase hexânica foi transferida para um balão e submetida à evaporação por evaporador rotativo à temperatura ambiente. O resíduo obtido foi diluído em 2 mL da mistura de acetonitrila e isopropanol na proporção de 85:15 (fase móvel) e filtrada com filtro de seringa (0,45 μm). Foi também utilizada a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com detector de arranjo de diodos (DAD) para a detecção do colesterol (SALDANHA, MAZALLI e BRAGAGNOLO, p.110, 2004). Para a otimização do método, realizou-se o planejamento fatorial fracionado de ordem 25-1, tendo como variáveis o tempo de agitação, a concentração da solução de KOH ([] KOH), o volume da mesma (V. KOH), o volume de água (V. ÁGUA), o volume de Hexano (V.HEXANO) e o tempo de agitação (T. AGITAÇÃO), proporcionando 16 experimentos com 3 repetições do ponto central, totalizando dessa forma 19 ensaios. O ensaio de recuperação foi realizado, em triplicata, através da fortificação dos produtos com quantidades suficientes de soluções dos padrões de colesterol para obtenção das seguintes concentrações após análise: 75, 150 e 300µg mL-¹.
Resultado e discussão
O diagrama de Pareto (Figura 1) obtido no planejamento fatorial fracionado
permitiu verificar que nenhuma das variáveis influenciou no processo de
extração.
É possível perceber que as superfícies de respostas (Figura 2) indicam através
da intensificação da coloração vermelha que no primeiro gráfico o nível superior
da concentração de KOH e o nível inferior do volume do mesmo, ou seja, 8 mL da
solução de KOH 3% (m/v) foi o primeiro ponto ótimo da extração. No segundo
gráfico é possível observar que a parte vermelha indica que o nível superior do
volume de hexano e o nível inferior do volume de água adicionado favoreceram. Já
na terceira superfície, mostra que o nível inferior do tempo de agitação
apresenta melhor resultado na extração do colesterol. E, a partir das
superfícies de respostas geradas, foi possível determinar que as condições
ótimas para a extração do colesterol no composto lácteo é de 8,0 mL de KOH 3%
(m/v) em agitação por 1 hora, com adição de 4,0 mL de água e finalizando com
lavagem utilizando 12,0 mL de hexano.
Depois de ter encontrado a condição ótima para a extração, foi então realizado o
ensaio de recuperação. Os resultados encontrados são: para a concentração de
75µg mL-¹ foi obtido 125,29% de recuperação, para a concentração de 150µg mL-¹ a
porcentagem de recuperação foi de 128,16% e para a concentração de 300µg mL-¹,
obteve-se 126% de recuperação. É possível perceber que todas as recuperações
foram próximas a 120% e diante disso o método pode ser aplicado após avaliar
outros parâmetros de validação como linearidade, precisão e seletividade. Pois,
segundo Lanças (p.62, 2004), o percentual de recuperação ótimo e aceito para os
métodos analíticos de validação varia entre 70% e 120%.
Diagrama de Pareto exibindo os efeitos positivos e negativos para as variáveis a um nível de 95% de confiança.
Análise do ponto ótimo de extração para as variáveis em estudo.
Conclusões
A melhor condição experimental encontrada para extração de colesterol por saponificação a quente em composto lácteo, foi a utilização de 8,0 mL de KOH 3% (m/v) em agitação por 1 hora, com adição de 4,0 mL de água e finalizando com a lavagem com 12,0 mL de hexano. Com a condição ótima, o ensaio de recuperação foi realizado e os resultados para todas as concentrações foram próximos ao valor de ótima recuperação que é de 120%. Diante disso, o método pode ser aplicado após avaliar outros parâmetros de validação como linearidade, precisão e seletividade.
Agradecimentos
Referências
BRASIL. MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 28 de 12 de junho de 2007. Diário Oficial da União, 14 de junho de 2007, p.8. Composto lácteo. Brasília: 2007.
GALDÁMEZ, E. V. C. Aplicação das técnicas de planejamento e análise de experimentos na melhoria da qualidade de um processo de fabricação de um produto plástico. Universidade de São Paulo, São Carlos, 2002. 133 pag. Dissertação para obtenção do título de Mestre em Engenharia de Produção.
LANÇAS, F. M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise. São Carlos: Ed. RiMa, 2004. 62 p.
SALDANHA, T.; MAZALLI, M. R.; BRAGAGNOLO, N. Avaliação comparativa entre dois métodos para determinação do colesterol em carnes e leite. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v.24, n.1, p. 109-113, 2004.
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