Desenvolvimento de metodologia HILIC-UPLC-ELSD para separação de diastereoisômeros de polióis C4-C6 com potencial aplicação biotecnológica

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Teles, K.A. (EMBRAPA) ; Costa, P.P.K.G. (EMBRAPA) ; Damaso, M.C.T. (EMBRAPA) ; Abdelnur, P.V. (EMBRAPA) ; Rodrigues, C.M. (EMBRAPA) ; Vieira, F.S. (EMBRAPA)

Resumo

Neste estudo, metodologias para análise de polióis utilizando sistema UPLC com fase estacionária HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) foram desenvolvidas para separar compostos polares (polióis) com detecção por ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) e eluição em modo gradiente. Vários dos polióis analisados são diastereoisômeros, o que torna a separação complexa. Assim, foi verificado que nas condições de separação com baixas temperaturas, os isômeros de polióis C4 se separaram, enquanto os de maior massa molar (C6) co-eluíram. Por outro lado, observação inversa foi obtida com temperaturas elevadas (~73ºC). Desta forma, foi possível realizar a identificação inequívoca de 10 polióis variando o parâmetro temperatura em análises por HILIC-UPLC-ELSD.

Palavras chaves

Polióis; HILIC-UPLC-ELSD; Diastereoisômeros

Introdução

Polióis são carboidratos cujos grupos funcionais aldeído ou cetona foram reduzidos à hidroxila. Eles são utilizados pelos setores industriais de alimentos, farmacêutico e como blocos construtores em síntese química (ALMEIDA et al, 2012). Com o crescimento da indústria energética do biodiesel, aumenta-se a produção de biodiesel, e seus coprodutos: tortas e glicerina. A grande quantidade de glicerina formada afeta a sustentabilidade produtiva e econômica da indústria do biodiesel, uma vez que o aumento da oferta deste coproduto e a redução da sua demanda diminuem significativamente seu valor comercial (MOTA et al, 2009). Uma alternativa para contornar a situação consiste na bioconversão da glicerina bruta por fermentação microbiana. Este processo se caracteriza pelo uso de microrganismos para a conversão da glicerina em outras moléculas de maior valor agregado como polióis e ácidos orgânicos (KOGANTI et al., 2011; WEST, 2015). Diante do cenário de tamanha perspectiva para a bioconversão da glicerina bruta e sua aplicação em biorrefinarias, surge a necessidade de desenvolver metodologias analíticas capazes de diferenciar o conjunto de isômeros que pode ser produzido em processos biotecnológicos (RODRIGUES, 2012) e oferecer vantagens aos métodos tradicionais de HPLC que apresentam sempre maior tempo de análise, maior consumo de reagentes e menor seletividade de separação, principalmente quando se trata de isômeros (PAPARIZOU et al., 2013). Polióis C4-C6 apresentam inversões de alguns dos grupos ligantes para os compostos de mesma fórmula molecular configurando a ocorrência de diastereoisômeros e a separação destes compostos é complexa. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para separação de diastereoisômeros de polióis por HILIC-UPLC-ELSD.

Material e métodos

Para o desenvolvimento do método de separação foram utilizados 10 padrões de polióis: treitol, eritritol, fucitol, ribitol, xilitol, arabitol, sorbitol, iditol, manitol e galactiol Para a fase móvel foram usadas água Milli-Q, acetonitrola e ácido trifluoroacético a 0,05% como modificador químico na fase aquosa. Os padrões e reagentes da fase móvel foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Neste trabalho foi utilizado um cromatógrafo líquido de ultra eficiência UPLC equipado com detector ELSD (Acquity H-class, Waters®) e coluna HILIC BEH Amide (2,1 X 150 mm; 1,7 μm, Waters®). Uma solução contendo a mistura dos polióis na concentração individual de 350 µg/mL foi empregada no desenvolvimento do método.

Resultado e discussão

O estudo foi iniciado com base na condição pré-otimizada, com base em trabalhos semelhantes conduzidos na Embrapa Agroenergia (FONTES, 2013). A Tabela 1 e 2 e Figura 1 Descrevem as condições utilizadas bem como o cromatograma. Nessas condições foi possível separar 6 dos 10 polióis estudados, sendo observada a co- eluição completa entre sorbitol e iditol (pico 7+8, Figura 1). Para tentar resolver o problema da co-eluição parcial do eritritol e treitol (picos 1 e 2) e completa para sorbitol e iditol (pico 7+8), um estudo de avaliação do comportamento de separação em função da variação da temperatura da coluna foi realizado. Nesta ocasião, o estudo foi feito inicialmente na temperatura de 30ºC com incrementos de 10ºC até alcançar a temperatura máxima de 80ºC, em seguida o método foi otimizado buscando valores intermediários entre as duas condições com melhor desempenho (70-80ºC). Os demais parâmetros foram mantidos. Cada avaliação foi feita em triplicata e a Figura 2 destaca as melhores condições de separação obtidas. Em comparação ao resultado da Figura 1, ficou evidente que a redução da temperatura (30ºC, Figura 2A) favorece a separação do par C4: treitol/eritritol. Valores de temperatura mais baixos viabilizam maior interação entre analito e fase estacionária, resultando em picos mais bem resolvidos no início do cromatograma. A elevação da temperatura reduz essa interação, fato que compromete a separação de substâncias com menor massa molar (Figura 2B). Essa observação é inversa quando se avalia o comportamento do par C6: sorbitol/iditol que apresenta co-eluição total nas temperaturas de 30-70ºC. Neste caso, a separação parcial de C6: incluindo sorbitol, iditol, manitol e galactiol ocorre apenas na temperatura de 73ºC, condição que permite detectar os 4 diastereoisômeros

Contém duas tabelas indicando as condições de eluição e do detector ELSD.


Figura 1 referente ao cromatograma a ser otimizado Figura 2 é referente ao cromatograma otimizado variando a temperatura do forno da coluna (30-70ºC)

Conclusões

A identificação inequívoca do conjunto de polióis empregados neste estudo foi alcançada, no entanto somente tornou-se possível utilizando-se duas condições de eluição com diferentes temperaturas para a fase estacionária, 30 e 73ºC. Em comparação aos métodos clássicos que utilizam HPLC, a metodologia de HILIC-UPLC-ELSD desenvolvida fornece vantagens como: diferenciação do conjunto de diastereoisômeros, redução no tempo de separação dos analitos, maior assertividade e seletividade na identificação dos polióis e redução no consumo de solventes da fase móvel.

Agradecimentos

CNPq e EMBRAPA.

Referências

ALMEIDA, J. R.; FAVARO, L. C.; QUIRINO, B. F. Biodiesel biorefinery: opportunities and challenges for microbial production of fuels and chemicals from glycerol waste. Biotechnology for Biofuels, v. 5, n. 1, p. 48, 2012.

FONTES, P. R. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para determinação de glicerol, xilitol e sorbitol por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada ao detector de espalhamento de luz evaporativo (UHPLC-ELSD). Monografia, 54 p, 2013.

KOGANTI, S.; KUO, T. M.; KURTZMAN, C. P.; SMITH, N.; JU L-K. Production of arabitol from glycerol: strain screening and study of factors affecting production yield. Applied Microbiology and Biotechnology, v 90, n. 1, p. 257-267, 2011.

MOTA, C. J.; SILVA, C. X. D.; GONÇALVES, V. L. Gliceroquímica: novos produtos e processos a partir da glicerina de produção de biodiesel. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 639-648, 2009

PAPARIZOU, E. C.; KARATAPANIS, A. E.; STALIKAS, C.D. Determination of saccharides in aerosols by hydrophilic interaction liquid chromatography-evaporative light scattering detection after preconcentration/clean-up on magnetic titania. Analytical Methods, v. 5, n. 11, p. 2802-2808, 2013

RODRIGUES, C. M. Análises químicas para a cadeia produtiva das biorrefinarias. In: Biorrefinarias: Presente e futuro, p. 1 - 44, 2012.

WEST, T. P. Fungal biotransformation of crude glycerol into malic acid. Zeitschrift für Naturforschung C. v. 70, n. 5-6, p. 165–167, 2015