Detecção de Escherichia coli através da amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (LAMP) em microchip de poliéster-toner (PeT)

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Oliveira, K.G. (UFG) ; Borba, J.C. (USP) ; Bailão, A.M. (UFG) ; Carrilho, E. (USP) ; Duarte, G.R.M. (UFG)

Resumo

Plataformas microfluídicas desenvolvidas para detecção de patógenos demonstram grande potencial para diagnósticos moleculares rápidos de doenças infecciosas. O presente trabalho realizou a detecção da bactéria Escherichia coli (E. Coli), por meio da utilização da técnica molecular LAMP. A reação foi aquecida isotermicamente a 66 °C por 60 min sendo o sucesso da reação confirmado por eletroforese e/ou visualização da fluorescência através da adição de um intercalador. Os resultados demonstraram que a LAMP possui grande potencial no desenvolvimento de métodos de detecção de patógenos para diagnósticos point-of-care, devido à simplicidade da instrumentação requerida para sua realização, utilizando apenas um banho seco, o que pode ser facilmente desenvolvido para uso em campo.

Palavras chaves

LAMP; microdispositivo de PeT; E.coli

Introdução

Técnicas moleculares baseadas na amplificação de DNA têm se tornado ferramentas poderosas para identificação precisa de patógenos como a E. coli (SANTOS, 2011; PARIDA, et al., 2007). A E. coli é a espécie de maior relevância clínica, sendo o principal agente de infecções urinárias. Está também associada a pneumonias em ambiente hospitalar, septicemias, abcessos e a gastroenterites (TUMBARELLO et al. 2008). Apesar de existirem técnicas que possuem grande especificidade para sua detecção, como a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), a complexidade de trabalhar com elas desfavorecem a adequação de tais metodologias em laboratórios com recursos limitados ou aplicações no point-of-care. Diferentes métodos moleculares de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos foram desenvolvidos na tentativa de eliminar o uso de termocicladores. A amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), desenvolvida no ano 2000 (NOTOMI, et al. 2000), corresponde a um método rápido e simples com grande sensibilidade baseada no deslocamento da fita do ácido nucleico. Na área de diagnósticos de doenças infecciosas há, cada dia mais, a necessidade de métodos mais rápidos, portáteis e precisos. A microfluídica é uma tecnologia que tem demonstrado muitas aplicações nesse sentido e promete ter forte impacto em um futuro próximo nas ciências da saúde, gerando plataformas de baixo custo para implementação de diversas técnicas de diagnósticos, incluindo os diagnósticos moleculares para detecção e identificação de patógenos. Dispositivos capazes de promover detecção rápida de E.coli, contribuirão para reduzir taxas de mortalidade, hospitalização, além de oferecer a possibilidade da realização de exames em locais com menor infraestrutura.

Material e métodos

Primeiramente, a mistura reacional foi preparada com as seguintes concentrações finais de cada reagente: 0,2 µM dos iniciadores externos F3 e B3, 1,6 µM dos iniciadores internos, 0,8 µM dos iniciadores loop LF e LB, 5M de betaína, 8 mM de MgSO4, 1 mM dNTP, 8U/µL BST, Tampão Bst (10x contendo 20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH2)SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100), 16 ng µL-1 de DNA E. coli. Os microdispositivos de PeT contendo uma câmara reacional para realização da LAMP,foram fabricados como descrito anteriormente por Duarte et al. em 2011, utilizando 4 filmes de poliéster, divididos em partes intermediárias, topo e base. Nas partes intermediárias, os filmes de poliéster (transparência) recobertos com toner foram recortados como o auxílio de um cortadora a laser para criar as câmaras medindo 18 mm x 1,2 mm. Cinco microlitros (5 μL) da mistura reacional foram inseridos no microchip e a reação foi aquecida isotermicamente a 66 °C por 60 min, seguida da inativação da enzima aquecendo a reação por 2 min a 80 °C. Após o final da reação, a solução foi retirada da câmara reacional e levada ao Bioanalyzer para separação e detecção dos produtos amplificados ou levada a um microtubo no qual foi inserido um intercalador de DNA fluorescente, permitindo a confirmação da amplificação de forma visual.

Resultado e discussão

O sucesso da amplificação dos fragmentos de DNA da bactéria E.coli ocorreu em 60 min (reação aquecida a 66 °C) evidenciando que tanto a transparência quanto o toner são compatíveis com todos os reagentes necessários para a realização da LAMP. A confirmação dos produtos de amplificação por separação eletroforética se deu pela presença de vários picos no eletroferograma (Figura 1), característico da LAMP devido à formação dos loops propiciarem cópias inversamente alternadas do alvo não amplificando o fragmento malB da E.coli linearmente. (CHIARI, 2010; NOTOMI et al., 2000). A confirmação do sucesso da LAMP realizada nos microchips de PeT também foi realizada através da adição do intercalador BoBo e com isso observada a fluorescência de duas maneiras diferentes. Uma delas foi a medida direta da fluorescência desenvolvida pela solução através da inserção do intercalador dentro da câmara reacional após o final da reação. A fluorescência desenvolvida foi medida com o auxílio de detector de fluorescência induzida a laser (LIF) como mostrado na Figura 2A. A segunda maneira foi a visualização a olho nu, adicionando o agente intercalador de DNA e submetendo a solução a uma iluminação UV. Como pode ser visto na Figura 2B a fluorescência pode ser visualizada. Uma próxima etapa será tentar visualizar a fluorescência a olho nu após o fim da reação de amplificação sem a retirada da solução do microchip. Para isso, pretende-se avaliar a utilização de diferentes colorações de toner na microfabricação da câmara, e ainda as dimensões e design da câmara reacional que favorecerão esta visualização.

Eletroferograma mostrando os produtos de amplificação da reação LAMP realizada em um microchip de PeT com DNA de E.coli.


A)Medida da fluorescência realizada diretamente na câmara reacional do microchip de PeT desenvolvida pelo DNA amplificado pela LAMP. B)Detecção visual

Conclusões

Os resultados demonstraram que é possível realizar a amplificação de DNA nos dispositivos de PeT através da LAMP. O sucesso da amplificação de DNA nos microchips de PeT demonstram que tanto a transparência quanto o toner são compatíveis com todos os reagentes necessários para LAMP. A próxima etapa do trabalho é a amplificação de DNA de E. coli através da LAMP a partir de amostra intacta (soro, urina) e detecção visual do produto on-chip. O objetivo final é desenvolver uma análise genética completa para detecção de E. coli em uma única etapa e sem a necessidade de equipamentos sofisticado.

Agradecimentos

CAPES

Referências

SANTOS, M.A.F.Desenvolvimento de métodos moleculares para detecção de Theileria annulata. Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina. Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.50 f. 2011
PARIDA, M.M.; SANTHOSH, S.R; TRAÇO, P.K.; TRIPATHI, N.K.; LAKSMI, V.; MAMIDI, N.; SHRIVASTVA, A.; GUPTA,N.; SAXENA, P.; BABU, J. P.; RAO, P.V.L; MORITA, K. Rapid and Real-Time Detection of Chikungunya virus by reverse transcription Loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. Vol 45, n.2, p. 351-357, 2007.
NOTOMI,T.;OKAMA,H.;MASUBUCHI,H.;YONEKAWA,T;WATANABLE,K.;AMINO,N.;HASE,T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res., vol 28, n. 12, e63, 2000.
CHIARI, M.F.Nova Metodologia de diagnóstico para Ehrlichia Canis:PCRXLAMP. Dissertação para a obtenção do título de mestre em Biotecnologia.USP.São Carlos,SP.p. 53-60.2010.
TUMBARELLO, M.; SALI, M. Bloodstream Infections Caused by Extended- Spectrum-{beta}-Lactamase- Producing Escherichia coli: Risk Factors for Inadequate Initial Antimicrobial Therapy. Antimicrob. Agents Chemother, vol. 52, n. 9, p. 3244-3252, 2008.