DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO POR UPLC-PDA PARA DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS OBTIDOS EM PROCESSOS DE BIOCONVERSÃO DE GLICERINA

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Vieira, F.S. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Souto, A.L. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Costa, P.P.K.G. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Damaso, M.C.T. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Abdelnur, P.V. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Rodrigues, C.M. (EMBRAPA AGROENERGIA)

Resumo

O trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de método analítico para identificar ácidos carboxílicos que podem ser produzidos no processo de bioconversão de glicerina. A glicerina, coproduto da produção do biodiesel, possui baixo valor comercial e microrganismos podem convertê-la em substâncias de maior valor agregado. No estudo pretende-se monitorar a conversão da glicerina em ácidos orgânicos de forma rápida e eficiente, utilizando cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) acoplada a detector de arranjo de fotodiodos (PDA). Nas condições otimizadas, foi possível identificar seis ácidos orgânicos em 5 min de análise. Foi empregada eluição isocrática com solução aquosa tamponada com KH2PO4 a 0,01 M com pH 2 e metanol na proporção de 98:2 e detecção UV em 210 nm.

Palavras chaves

UPLC; High Throughput Analysis; Ácidos Orgânicos

Introdução

O Biodiesel é tipicamente obtido a partir de óleos vegetais por processos de transesterificação. Pesquisas sugerem que o biodiesel seja menos poluente do que o diesel de origem fóssil. Entretanto, na produção do biodiesel é formada a glicerina bruta, coproduto de baixo valor comercial. A glicerina corresponde a cerca de 10% da massa total dos produtos gerados durante a produção do biodiesel. A conversão da glicerina em outros produtos químicos de maior valor agregado pode ainda promover a viabilidade comercial do biodiesel (QUISPE et al, 2013). Diferentes substâncias podem ser obtidas a partir da bioconversão da glicerina, dentre elas ácidos orgânicos, como o ácido succínico (ASAD-UR- REHMAN et al, 2008). Diversas metodologias têm sido empregadas para detecção de ácidos em diferentes matrizes, sendo a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (HPLC-PDA) a técnica mais utilizada devido à sua simplicidade (AQUINO et al, 2015). No entanto, há poucos estudos que utilizam cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) para análise de ácidos orgânicos. Este trabalho tem como objetivo desenvolver um método de análise rápido e simples baseado em cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) para detecção e quantificação de ácidos orgânicos provenientes da bioconversão da glicerina. Os compostos-alvo desse estudo são os ácidos: cítrico, glicérico, lático, quínico, oxálico e succínico, que são possíveis compostos químicos que podem ser obtidos a partir da bioconversão.

Material e métodos

As análises foram realizadas em um sistema cromatográfico UPLC-PDA modelo Acquity H-class (Waters®) e coluna HSS T3 (2,1 X 150 mm, 1,8 µm) (Waters®) equipada com a respectiva pré-coluna. Utilizaram-se soluções padrão em concentrações conhecidas de 1 mg/mL dos ácidos: cítrico, glicérico, lático, quínico e succínico e de 0,25 mg/mL do ácido oxálico (Sigma-Aldrich® e Supelco®). Os padrões foram diluídos em água ultrapura para análise com PDA. A fase móvel utilizada foi solução tampão fosfato de potássio monobásico 0,01 M pH 2,0 e metanol. A separação foi realizada de modo isocrático à vazão de 0,4 mL/min com 98% de tampão e 2% de metanol.

Resultado e discussão

Diferentes condições de análises foram avaliadas a fim de se obter boa resolução cromatográfica para todos os ácidos em curto período de tempo. Testes utilizando o detector PDA em 210 nm foram realizados com a coluna HSS T3 (2,1 X 150 mm, 1,8 µm, Waters®). Foram avaliados diferentes valores de pH de fase móvel a fim de se encontrar a condição de equilíbrio químico em que todos os ácidos estivessem em uma única forma. Os valores de pH testados foram 2,0; 2,2; 2,5; 3,0; 3,5 e a melhor resolução foi obtida com o pH 2,0. Nessa condição os ácidos apresentam-se na forma não ionizada. O método otimizado utilizou eluição isocrática em 5 minutos com tampão fosfato de potássio monobásico 0,01 M pH 2,0 e metanol (98:2). A melhor condição encontrada foi usando tampão fosfato de potássio monobásico: pH 2,0, temperatura do forno da coluna: 30°C, vazão: 0,4 mL/min, volume de injeção: 1 µL. A ordem de eluição dos compostos foi ácido oxálico, glicérico, quínico, lático, cítrico e succínico. Na Figura 1 é apresentado o cromatograma referente à eluição dos ácidos na condição otimizada e na Figura 2 as respectivas estruturas químicas dos ácidos. Pode-se concluir que quanto maior a quantidade de carbonos na cadeia alifática, mais retidos na coluna ficam os ácidos orgânicos estudados. Variou-se a proporção de fase orgânica (metanol) para avaliar a retenção dos ácidos na coluna. Foi verificado que o aumento de metanol na fase móvel para 3% não contribui para aumentar o tempo de retenção dos ácidos. Sob a condição otimizada de tampão fosfato de potássio monobásico:metanol (98:2), todos os ácidos eluíram antes de 4 minutos. A vazão de 0,4 mL/min juntamente com o reduzido tempo de análise fornece consumo reduzido de solvente quando comparado a métodos que utilizam HPLC.

Cromatograma da mistura de (1) ácido oxálico, (2) ácido glicérico, (3) ácido quínico, (4) ácido lático, (5) ácido cítrico e (6) ácido succínico.


Estruturas químicas dos ácidos oxálico (1), glicérico (2), quínico (3), lático (4), cítrico (5) e succínico (6).

Conclusões

O método em estudo apresenta várias vantagens sobre os que utilizam o tradicional HPLC, como uma melhor eficiência cromatográfica, redução no tempo de análise e economia de solvente ao reduzir o consumo de fase móvel. Foi possível estabelecer um método por UPLC-PDA com tempo de corrida de 5 minutos e que separa os ácidos oxálico, glicérico, quínico, lático, cítrico e succínico. Essa é uma técnica promissora para análise High Throughput para screening de microrganismos eficientes para a bioconversão de glicerina em ácidos orgânicos.

Agradecimentos

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Referências

AQUINO, A. C. M. S.; AZEVEDO, M. S.; RIBEIRO, D. H. B.; COSTA, A. C. O.; AMANTE, E. R. Validation of HPLC and CE methods for determination of organic acids in sour cassava starch wastewater. Food Chemistry, v. 172, p. 725–730, 2015.

ASAD-UR-REHMAN; WIJESEKARA, R. G. S.; NOMURA, N.; SATO, S.; MATSUMURA, M. Pre-treatment and utilization of raw glycerol from sunflower oil biodieselfor growth and 1,3-propanediol production by Clostridium butyricum. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 83, p. 1072–1080, 2008.

QUISPE, C. A. G.; CORONADO, C. J. R.; CARVALHO, Jr J. A. Glycerol: Production, consumption, prices, characterization and new trends in combustion. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v. 27, p. 475–493, 2013.