OTIMIZAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA SEPARAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS, MONOSSACARÍDEOS, ÁLCOOIS E AÇÚCARES FOSFATADOS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Gonçalves Campos, C. (UFG) ; Ribeiro, J.A. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Martins Rodrigues, C. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Pinto Kalil Costa, P. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Verardi Abdelnur, P. (EMBRAPA AGROENERGIA)

Resumo

A técnica de cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS) possibilitou a separação e identificação de dezenove metabólitos, correspondentes a ácidos orgânicos, monossacarídeos, álcoois e açúcares fosfatados, presentes nas vias da glicólise, pentose fosfato e ciclo do ácido tricarboxilíco. Diferentes fases estacionárias e fases móveis, modos de eluição e temperatura foram testadas para obter o melhor método de separação dos metabólitos estudados. O método baseado em cromatografia por pareamento iônico (IPC) mostrou-se eficiente para a separação de pentoses e hexoses fosfatadas e ácidos orgânicos utilizando a coluna HSS-T3 (Waters). Os monossacarídeos e álcoois foram separados utilizando cromatografia HILIC com a coluna BEH-amida (Waters).

Palavras chaves

UHPLC-MS; espectrometria de massas; metabólitos

Introdução

A cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS) é uma técnica de separação que permite a determinação simultânea de analitos, principalmente aqueles em baixas concentrações e presentes em matrizes complexas (Buscher et al, 2009). Diversos métodos podem ser desenvolvidos em função dos diferentes modos de separação disponíveis, como por exemplo, a cromatografia por interação hidrofílica (do inglês, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC), que envolve o uso de fase estacionária polar com a eluição dos analitos em ordem decrescente de hidrofobicidade e a cromatografia por pareamento iônico (do inglês, Ion Pair Chromatography - IPC) que utiliza fase estacionária apolar e fase móvel contendo um contra-íon orgânico que pode ser um sal de amônio quaternário ou um alquilsulfonato (Sun et al, 2012). O emprego da técnica analítica de UHPLC-MS possui ampla aplicação em diversas áreas, incluindo a biotecnologia e a engenharia metabólica que visa o melhoramento genético de microrganismos (Luo et al, 2007). Este trabalho tem por objetivo a otimização das condições cromatográficas a fim de identificar e separar os metabólitos intracelulares presentes nas vias da glicólise, pentose fosfato e ciclo do ácido tricarboxilíco (TCA) por UHPLC-MS. Vinte e um compostos foram utilizados, sendo: acetil Co-enzima A, acetaldeído, ácido α-cetoglutárico, ácido málico, ácido oxaloacético, glicose, xilose, glicerol-3-fosfato, glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato, di-hidroxiacetona fosfato, gliceraldeído-3-fosfato, ribose-5-fosfato, ribulose-5-fosfato, eritrose-4-fosfato, sedoheptulose-7-fosfato, xilulose, ácido fosfo(enol)pirúvico, glicerol, piruvato de sódio e xilitol. Diferentes parâmetros analíticos foram testados para obter as melhores condições de separação e resolução cromatográfica. Foram empregadas diferentes fases estacionárias, solventes e vazão de fases móveis, modos de eluição (isocrático e gradiente) e variação da temperatura. A espectrometria de massas baseada em ESI(-)-MS/MS e MRM (Multiple Reaction Monitoring) foi utilizada para garantir maior sensibilidade e seletividade durante a detecção dos metabólitos.

Material e métodos

Os padrões comerciais de metabólitos foram adquiridos da Sigma-Aldrich, os solventes utilizados foram adquiridos da Merck, grau HPLC. A separação dos compostos foi realizada utilizando UHPLC-MS, Acquity acoplado ao Xevo TQD, Waters. Como fonte de ionização empregou-se ESI(-)-MS (ionização por electrospray em modo negativo) e como analisador de massas um triplo quadrupolo (QqQ), Waters em modo MRM. Inicialmente foram realizados testes com a coluna BEH amida (2,1 x 150 mm x 1,7 µm, Waters) em diferentes composições de fase móvel, em modo gradiente e isocrático. As temperaturas do forno de coluna avaliadas variaram de 35°C a 60°C. Dois sais de amônio foram utilizados como modificadores: formiato (NH₄COOH) e acetato (CH₃COONH₄), em diferentes concentrações e proporções de acetonitrila (ACN) e água. Além destas, duas fases móveis preparadas com hidróxido de amônio foram testadas em modo gradiente: 1) Fase A: NH₄OH 0,05% (aquoso) + ACN 90/10 (v/v) e fase B: NH₄OH 0,05% (aquoso) + ACN 50/50(v/v) e 2) Fase A: NH₄OH 0,1% (aquoso) e fase B: ACN + NH₄OH 0,1%. Testes utilizando coluna de fase reversa do tipo C18 com grupo polar embutido HSS-T3 (2,1 x 150 mm x 1,8 µm, Waters), também foram realizados. Durante o desenvolvimento da cromatografia por pareamento iônico, dois reagentes foram testados: trietilamina (TEA) e tributilamina (TBA), empregando-se eluição por gradiente. A fase móvel A foi constituída por uma solução aquosa contendo o reagente do par iônico, e metanol (MeOH) foi utilizado como fase móvel B. As temperaturas do forno de coluna testadas foram: 35°C, 45°C e 50°C. Para a trietilamina testou-se duas concentrações: 1) TEA 5 mM + ácido fórmico 10 mM e 2) TEA 10 mM + ácido fórmico 20 mM. Para a tributilamina cinco diferentes composições de fases móvel foram testadas: 1) TBA 2 mM + CH₃COONH₄ 5 mM; 2) TBA 2 mM + ácido acético 3 mM + 5% (v/v) MeOH; 3) TBA 2 mM + ácido acético 4 mM + 5% (v/v) MeOH; 4) TBA 5 mM + ácido acético 10 mM + 5% (v/v) MeOH; e 5) TBA 10 mM + ácido acético 15 mM.

Resultado e discussão

Não foi possível determinar uma condição única de separação cromatográfica para os 21 metabólitos testados devido às diferentes características químicas destes compostos. Os monossacarídeos e álcoois foram separados utilizando a cromatografia HILIC com a coluna BEH-amida (Figura 1). Em geral, neste tipo de cromatografia é utilizado como solvente de eluição a mistura de água e acetonitrila (ACN) a qual são adicionados sais de amônio como modificador (Li et al, 2011). No entanto, a melhor condição obtida para esta classe de metabólitos foi aquela utilizando eluição por gradiente composta pela fase: A: NH₄OH 0,1% e B: ACN + NH₄OH 0,1%. Assim, xilose, xilulose, xilitol, glicose e glicerol, foram separados e identificados. Nos testes empregando a coluna HSS-T3 a tributilamina apresentou melhor resultado em relação a trietilamina. Isso pode se explicado pelo fato da tributilamina possuir um grupo alquil maior que a trietilamina aumentando o caráter hidrofóbico da molécula, e consequentemente proporcionando uma maior interação com a coluna (Luo et al, 2007). A melhor condição obtida foi aquela utilizando eluição por gradiente e fase móvel composta por tributilamina 5 mM, ácido acético 10 mM, 5% (v/v) MeOH (fase A) e MeOH (fase B), a 45°C. O mecanismo de interação do modo de separação IPC mostrou-se apropriado para a análise de pentoses e hexoses fosfatadas e ácidos orgânicos (Figura 2). Desta forma, catorze metabólitos foram separados e identificados: glicerol-3-fosfato, glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato, di-hidroxiacetona fosfato, gliceraldeído-3-fosfato, ribose-5-fosfato, ribulose-5-fosfato, eritrose-4-fosfato, sedoheptulose-7-fosfato, ácido málico, acetil Co-enzima A, ácido pirúvico, ácido fosfo(enol)pirúvico e ácido α-cetoglutárico. Por fim, dois compostos não puderam ser identificados em nenhum dos métodos: ácido oxaloacético, devido a um possível processo de degradação, e acetaldeído, possivelmente devido a sua característica volátil e baixo peso molecular.

Cromatograma de íons totais (TIC) dos metabólitos separados pelo método HILIC utilizando a coluna BEH amida (Waters).


Cromatograma de íons totais (TIC) dos metabólitos separados pelo método IPC utilizando a coluna HSS-T3(Waters).

Conclusões

Diversos metabólitos intracelulares presentes no metabolismo do carbono central formado pelas vias da glicólise, pentose fosfato e ciclo do ácido tricarboxílico, foram separados e detectados por UHPLC-MS. Dois métodos cromatográficos baseados em cromatografia por pareamento iônico (IPC) e cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) foram otimizados para a separação de 14 e 5 metabólitos, respectivamente. Os próximos passos serão a validação das metodologias desenvolvidas e estudos de quantificação destes metabólitos. O trabalho desenvolvido será futuramente aplicado para a determinação destes compostos em matrizes biológicas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a EMBRAPA e a CAPES pelo apoio institucional e financeiro.

Referências

BUSCHER, M. J.; CZERNIK, D.; EWALD, C. J.; SAUER, U.; ZAMBONI, N. Cross-Platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry, Zurich, v. 81, p. 2135-2143, mar. 2009.

LI, Y.; PTELOMY, A. S.; HARMONAY, L.; KELLOG, M.; BERRY, G. T. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, Ultra fast and sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry based assay for galactose-1-phosphate uridylyltransferase and galactokinase deficiencies. Molecular genetics and Metabolism, Boston, v. 102, p. 33-40, set. 2011.

LUO, B.; GROENKE, K.; TAKORS, R.; WANDREY, C.; OLDIGES, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, Julich, v. 1147, p. 153-164, fev. 2007.

SUN, T.; WETZEL, J. S.; JOHNSON, E. M.; SURLOW, A. B.; VOGT, J. Development and validation of a hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantificantion of lipid-related extracellular metabolites in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Chromatography B, Pittsburgh, v. 897, p. 1-9, Abr. 2012.