Desenvolvimento de protocolo analítico para identificação de proteínas em frutos de dendê utilizando MALDI(+)-TOF-MS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Rodrigues-neto, J. (UFG/EMBRAPA) ; Ricci-silva, M. (EMBRAPA) ; Santos, C. (EMBRAPA) ; Costa, P. (EMBRAPA) ; Ribeiro, J. (EMBRAPA) ; Siqueira, F. (EMBRAPA) ; Abdelnur, P. (EMBRAPA)

Resumo

O dendezeiro tem uma alta produção de óleo em seu fruto, chegando a 80% da massa seca de seu mesocarpo, tendo, portanto, um promissor papel na produção de biodiesel (LOEI et al., p. 5096-5109, 2013). A assinatura proteica dos frutos de dendê tem sido estudada e embora os protocolos se mostrem variados no preparo de amostra e análise, é essencial uma otimização nas condições de extração e análise no intuito de se padronizar o estudo de proteômica utilizando MALDI-MS. Neste trabalho foi feito um fingerprinting dos peptídeos e proteínas extraídos do fruto de dendê por MALDI(+)-TOF-MS para comparação de diferentes formas de extração e análise das amostras. A condição que apresentou os melhores resultados foi com uso de tampão Tris- SDS e matriz ácido dihidroxibenzóico (DHB).

Palavras chaves

Elaeis guineensis; espectrometria de massas; proteômica

Introdução

O dendê (Elaeis guineenses) é uma oleaginosa proveniente das regiões intertropicais da África, tendo hoje como principais produtores a Malásia e a Indonésia (de Vries, Sander C., et al., 2010). O Brasil produz cerca de 93 mil toneladas, sendo o Pará o maior produtor nacional. Na América Latina, Colômbia, Equador e Costa Rica atualmente suplantam o Brasil na produção do óleo de dendê (Valois, 2003). O óleo de dendê, também conhecido como óleo de palma bruto, é extraído do mesocarpo do fruto. Cerca de 80% da produção mundial do óleo de dendê é destinada a alguma aplicação alimentícia. Dentre essas finalidades podemos citar: azeite de dendê, margarinas, frituras, sorvetes, bolachas, dentre outras. Fora do segmento alimentício, o dendezeiro vem sendo amplamente estudado pelo seu potencial na produção de biodiesel a partir do óleo do seu fruto. Como a regulação biossintética do desenvolvimento do mesocarpo ainda não é bem entendida, diversos trabalhos surgem na tentativa de identificar os metabólitos e proteínas presentes no dendê (NEOH et al. p. 1920-1927, 2013). O preparo de amostra é um ponto crucial no desenvolvimento de protocolos analíticos, uma vez que é o responsável por extrair os compostos a ser analisados. Nesse trabalho, análises por fingerprinting MS por MALDI(+)-TOF-MS foram realizadas em amostras de frutos de dendê utilizando diversos parâmetros no preparo da amostra, como processo de delipidação, diferentes tampões de extração e matrizes para ionização, a fim de obter a maior quantidade de peptídeos e proteínas extraída e detectada.

Material e métodos

Os frutos de dendê foram coletados na Embrapa Cerrados e armazenados por 72 horas em temperatura ambiente. Dois protocolos foram realizados para a extração dos peptídeos e proteínas, com e sem uma etapa de delipidação total do mesocarpo. Primeiramente, 100 mg de extrato bruto do mesocarpo de frutos de dendê foram colocados em eppendorfs (três duplicatas) e submetidos a uma etapa de delipidação total, a partir da adição de 500 µL de uma solução de 1-butanol:clorofórmio (1:9). Este procedimento foi realizado duas vezes. Em seguida, 500 µL de acetona foram adicionadas duas vezes, e, por fim, 500 µL de éter de petróleo foi utilizado para finalizar a etapa de delipidação. Os tubos eppendorfs foram agitados em Minibeadbeater por 30 segundos e cada fração foi solubilizada em um tampão diferente: i) Bicarbonato de sódio 0,2 M; ii) Tris – SDS e iii) Bicarbonato de sódio – SDS. Para o segundo protocolo, não houve a etapa de delipidação, 100 mg de extrato bruto do mesocarpo foram inseridos em eppendorfs, e em seguida, as soluções tampões foram adicionadas. Os eppendorfs foram agitados em Minibeadbeater por 30 segundos. Para análises por espectrometria de massas, cada amostra (após procedimento de delipidação ou não) foi diluída na razão 1:20 em ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% e matriz (ácido sinapínico ou ácido 3,5- dihidróxibenzóico) e analisadas de massas no espectrômetro MALDI-TOF (Bruker Daltonics), utilizando uma faixa de massas m/z 4-60 k, laser 80%, 500 shots na frequência 200 Hz e modo linear positivo.

Resultado e discussão

A partir dos espectros de massas obtidos foi possível fazer a comparação dos diferentes protocolos analíticos de extração e análise do mesocarpo de frutos de dendê, a partir da identificação de peptídeos e proteínas. Analisando os espectros, foi possível concluir que a matriz de ácido dihidroxibenzóico (DHB) apresentou um maior número de peptídeos e proteínas detectadas e com uma melhor resolução de sinais quando comparada com a matriz de ácido sinapínico. Na Figura 1 são apresentados os resultados das análises realizadas utilizando matriz DHB. Estão ilustrado os espectros de massas obtidos utilizando 3 diferentes tampões de extração: bicarbonato, bicarbonato-SDS e Tris-SDS, para as amostras com e sem a etapa de delipidação. Analisando os espectros de massas de todas as condições testadas (Figura 1A a E), pode-se dizer que o melhor resultado obtido é utilizando o tampão Tris-SDS e matriz DHB, após delipidação (Figura 1C), uma vez que um maior número de peptídeos e proteínas foi detectado. Além disso, esta condição foi a que detectou a proteína de m/z 28.741 com maior intensidade.

Espectros de massas obtidos sob diferentes condições de tampão na extração e matriz na análise por MALDI(+)-TOF-MS.

Conclusões

Com base nos experimentos e resultados apresentados, o melhor protocolo de identificação de peptídeos e proteínas em frutos de dendê foi utilizando a etapa de delipidação, tampão Tris-SDS e matriz DHB. Os próximos passos serão identificar os peptídeos e proteínas detectadas, a partir das técnicas de HRMS (High Resolution Mass Spectrometry) e MS/MS.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Embrapa, CAPES, FINEP e UFG pelo apoio institucional e financeiro.

Referências

LOEI, Hendrick et al. Proteomic analysis of the oil palm fruit mesocarp reveals elevated oxidative phosphorylation activity is critical for increased storage oil production. Journal of proteome research, v. 12, n. 11, p. 5096-5109, 2013.

NEOH, Bee Keat et al. Profiling of metabolites in oil palm mesocarp at different stages of oil biosynthesis. Journal of agricultural and food chemistry, v. 61, n. 8, p. 1920-1927, 2013.

Valois, Afonso Celso Candeira. Benefícios e estratégias de utilização sustentável da Amazônia. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica. Texto para discussão, ISSN 1677-5473; 18).

de Vries, Sander C., et al. Resource use efficiency and environmental performance of nine major biofuel crops, processed by first-generation conversion techniques. Biomass and Bioenergy v. 34, n. 5, p. 588-601, 2010.