PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM CRIOGEL SUPERMACROPOROSO ATIVADO COM GLUTARALDEÍDO PARA A PURIFICAÇÃO DE LECTINAS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Tecnológica

Autores

Gonçalves, G.R.F. (UESB) ; Gandolfi, O.R.R. (UESB) ; Santos, C.M.S. (UESB) ; Bonomo, R.C.F. (UESB) ; Veloso, C.M. (UESB) ; Santos, L.S. (UESB) ; Fontan, R.C.I. (UESB)

Resumo

Objetivou-se neste trabalho produzir e caracterizar um criogel supermacroporoso ativado com glutaraldeído visando à purificação de lectinas. Para isso uma solução contendo o carboidrato modificado n-acetil-D-glicosamina foi recirculada entre os criogéis ativados. O criogel produzido apresentou uma imobilização de 147,77 miligramas de carboidrato por grama de criogel seco, apresentando boa capacidade de imobilização. Em seguida, os criogéis foram caracterizados, e as análises realizadas indicaram elevada capacidade que os criogéis possuem de armazenar água em sua estrutura, além de uma elevada fração de macroporos. Mais estudos são necessários, mas a produção de tais matrizes é promissora, com potencial para serem utilizados em processos de purificação de lectinas.

Palavras chaves

SEPARAÇÃO; MONÓLITOS; BIOMOLÉCULAS

Introdução

As lectinas são uma classe estruturalmente diversa de proteínas, que possuem habilidade de se ligar a carboidratos com considerável especificidade (SHARON, 1993). São proteínas ligantes de origem não imunológica e oligomérica, ou seja, constituídas de monômeros arranjados tridimensionalmente, formando dímeros, tetrâmeros ou heterodímeros. Podem ser monovalentes (um sítio glicídico por monômero) ou polivalentes (mais de um sítio glicídico por monômero). Devido às propriedades ligantes, essas biomoléculas possuem diversas atividades biológicas, tais como a habilidade de aglutinar eritrócitos, linfócitos, fibroblastos, espermatozoides, fungos, bactérias e células vegetais (SINGH et al., 1999). Diversas técnicas comuns na purificação de proteínas podem ser utilizados para a purificação de lectinas. Algumas técnicas comumente utilizadas são cromatografia de troca iônica (SANTI-GADELHA et al., 2006), cromatografia de filtração em gel (MOURA et al., 2006), precipitação com sulfato de amônio (COELHO E SILVA, 2000), entre outras. Porém, devido a habilidade das lectinas em se ligar a carboidratos e outras glicoproteínas, a técnica mais utilizada na purificação deste grupo de proteínas é a cromatografia de afinidade (TYAGI et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2002; ROY et al., 2005). Tal princípio vem sendo amplamente explorado, sendo estudada a interação com goma guar (TYAGI et al., 1996), derivados de galactose (OLIVEIRA et al. 2002), manose (OURTH E ROSE, 2011) e proteínas (JUNG et al., 2003), dentre outros. Os leitos fixos cromatográficos tradicionais apresentam uma alta capacidade de saturação, devido à elevada área superficial das partículas adsorventes. Entretanto, a presença de grandes biomoléculas ou meios altamente concentrados desafiam sua capacidade e produtividade. Além disso, a ampliação de escalas em leitos empacotados contendo adsorventes pouco resistentes é muito limitada, devido a fatores mecânicos e instabilidade do leito (STICKEL e FOTOPOULOS, 2001). Esses problemas, em especial os problemas de transferência de massa levaram ao desenvolvimento de monólitos macroporosos para purificação de macromoléculas. As colunas monolíticas poliméricas, também denominadas de materiais cromatográficos de quarta geração, são consideradas o que há de mais moderno no setor de matrizes cromatográficas. Devido à estrutura de macroporos interconectados de grandes dimensões, o fluxo através dos poros é puramente convectivo e a resistência à transferência de massa é baixa (HAHN et al., 2002; PODGORNIK et al., 2000; GUIOCHON, 2007). Entre os possíveis polímeros empregado na síntese desses compostos destaca-se os monólitos macroporosos de poliacrilamida, obtidos da polimerização de moléculas de acrilamida (Aam) com o agente formador de ligações cruzadas N, N’-metileno-bis-acrilamida (BAam) adicionados ou não de outros monômeros (como o alil-glicidil éter, AGE), sob condições de congelamento moderado (-10 °C a -20 °C), pela técnica conhecida como criogeleificação (PLIEVA et al., 2004b). Os monólitos assim sintetizados são chamados de criogéis pAam, e sua utilização vem sendo reportada por diversos autores (DRAGAN et al., 2012; PLIEVA et al., 2004a; YAO et al., 2007). Modificações podem ser realizadas na estrutura dos criogéis visando aumentar sua capacidade de purificação. Para propósitos de purificação de lectinas uma alternativa potencial é a imobilização de carboidratos modificados (contendo grupamento amina) na superfície dos criogéis, dada a sua habilidade em se ligar a tais compostos. Diversos métodos de ativação da superfície dos criogéis seguido da imobilização de biomoléculas têm sido relatados (MALLIK; HAGE, 2006; KHAN et al., 2012; TÜZMEN; KALBURCU; DENIZLI, 2012; UYGUN et al., 2012). Uma das técnicas que pode ser utilizada para imobilização de carboidratos modificados na superfície dos criogéis é o método do glutaraldeído. Nessa técnica há um maior espaçamento entre o agente imobilizado e a superfície monólito, o que acaba evitando efeitos de impedimento estérico (LUO et al., 2012), podendo aumentar a capacidade de ligação dos biocompostos a serem imobilizados e até mesmo a capacidade de purificação da coluna. Diante do exposto, o objetivo nesse trabalho é a produção e caracterização de um criogel supermacroporoso ativado com glutaraldeído, visando à purificação de lectinas.

Material e métodos

REAGENTES Os reagentes utilizados no experimento estão descritos ao longo da metodologia. Todos os reagentes utilizados possuíam, no mínimo, grau de pureza PA-ACS. SÍNTESE DOS CRIOGÉIS Para síntese dos criogéis, foi adaptada metodologia proposta por KUMAR et al. (2006). Resumidamente, uma solução aquosa contendo 6% de monômeros (AAm + AGE + BAAm), na proporção mássica de 4:1 (AAm+AGE):BAAm e 5:1 AAm:AGE foi preparada em banho de gelo. Foram adicionados então 1% APS e 1% de TEMED em relação a massa total de monômeros. A solução foi vertida em seringas e mergulhada em banho termostático a -20,0°C por 24 h. Em seguida, as seringas foram colocadas a temperatura de 4°C por 4 h para descongelamento. Os criogéis foram secos em estufa a 60°C e pesados em balança analítica. Por fim, foram lavados com 150 ml de água destilada, e foram novamente secos e pesados, para verificar por diferença a quantidade de monômeros que não se polimerizou. As soluções de lavagem e ativação foram percoladas através da coluna utilizando bomba peristáltica. FUNCIONALIZAÇÃO DOS CRIOGÉIS Para a imobilização do n-acetil-D-galactosamina utilizando o método do glutaradeído foram utilizadas metodologias adaptadas propostas por KUMAR et al. (2003) e PETRO et al. (1996). Primeiramente, os criogéis foram lavados com 30 mL de etanol puro, seguido de 30 mL de etanol + água destilada (1:1) e por fim 30 mL de água destilada. Os criogéis foram então lavados com 30 mL de tampão carbonato 50 mM (pH 9,5). Lavou-se então com 40 mL de etilenodiamina 0,5 M em tampão carbonato, em recirculação por 4,5 horas. Após, os criogéis foram lavados com água até atingir pH neutro, seguido de 30 mL de tampão fosfato 0,1 M em pH 7,2. Posteriormente, foram lavados com 40 mL de uma solução de glutaraldeído 5% m/v em tampão fosfato, em recirculação por 4,5 horas. Em seguida, foi preparada uma solução de 4 mg.ml^-1 de n-acetil-D-glicosamina no tampão fosfato, e recirculada nas colunas por 16 horas. Após esse tempo, a quantidade de carboidrato imobilizado foi quantificado por diferença na solução de n-acetil-D- glicosamina antes e após a recirculação, segundo MILLER (1959). As colunas foram lavadas com 40 mL de borohidreto de sódio 0,1 M em tampão carbonato, em recirculação por 3,5 horas. Lavou-se então com 100 mL de água destilada, seguido de 40 mL de etanolamina 0,1 M no tampão carbonato e novamente 40 mL de água destilada. Finalmente, os criogéis foram lavadas com 50 mL do tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2). CARACTERIZAÇÃO DOS CRIOGÉIS Seis criogéis foram caracterizados em relação à capacidade de inchamento, grau de expansão, fração de macroporos e fração de polímero seco. Para a capacidade de inchamento e grau de expansão foram utilizadas metodologias propostas por SAVINA et al. (2005) e FONTAN (2013), respectivamente. Já as frações de macroporos e de polímero seco foram obtidas de acordo com PLIEVA et al. (2004).

Resultado e discussão

O criogel monolítico supermacroporoso foi produzido pela crio- copolimerização (polimerização em temperaturas de congelamento) dos monômeros AAm (principal monômero da estrutura), MBAAm e AGE. A utilização da MBAAm é fundamental para promover o enlace das cadeias de Aam formando as ligações cruzadas necessárias para a formação da cadeia polimérica (COOPER, 1977). Já a utilização do AGE provoca um aumento na resistência estrutural do criogel, além de promover a formação de grupos epóxi na superfície dos criogéis (criogel epóxi-ativado) (ARVIDSSON et al., 2003), que são de fundamental importância na imobilização de carboidratos modificados utilizando o método do glutaraldeído, como será explicado posteriormente. O APS e o TEMED funcionam como agente iniciador e acelerador da reação de polimerização, respectivamente. Os criogéis produzidos apresentaram estruturas consistentes, cilíndricas, esponjosas quando umedecidas, lisas e porosas, conforme relatado por diversos autores (PERSSON et al., 2004; ARVIDSSON et al., 2002; YAO et al., 2006a). Ao serem retirados das colunas, os criogéis puderam ser espremidos, removendo o excesso de água livre no interior dos poros, sem ter a sua estrutura danificada. Após serem mergulhados em água, os criogéis facilmente voltaram à sua forma original. O mesmo ocorreu após os processos de secagem e reidratação de tal monólito. IMOBILIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS PELO MÉTODO DO GLUTARALDEÍDO A ativação de criogéis com glutaraldeído apresenta-se como uma alternativa potencial para a imobilização de moléculas em sua estrutura. Diversos trabalhos de imobilização de enzimas e proteínas utilizando tal método são facilmente encontrados na literatura (PETRO et al., 1996; LUO et al.,2002), porém não foram encontrados trabalhos para imobilização de carboidratos utilizando tal técnica. Para que essa imobilização torne-se possível, os carboidratos a serem imobilizados devem ser aminados, ou seja, possuírem o grupamento amina na estrutura, o mesmo encontrado nas enzimas e proteínas. Nessa técnica, o criogel epóxi-ativado é convertido à forma amina- ativada pela reação dos grupos epóxi com etilenodiamina. O criogel amina-ativado reage com o glutaraldeído, formando um criogel aldeído-ativado, capaz de ligar- se aos grupamentos aminas, formando uma base de Schiff (MALLIK e HAGE, 2006). Como descrito anteriormente, a quantidade de carboidrato modificado n- acetil-D-glicosamina que ficou imobilizado na superfície do criogel ativado com glutaraldeído foi obtida por diferença a partir da solução de carboidrato antes e após a recirculação. A quantidade imobilizada encontrada nesse experimento foi de 147,77 mg de carboidrato por g de criogel seco, correspondendo a uma elevada quantidade de carboidrato imobilizado. Tal valor pode ser explicado primeiramente pelo fato de o criogel produzido possuir uma grande quantidade de grupos epóxi reativos e também pelo fato de ao se utilizar a ativação com glutaraldeído ocorrer a formação de braços espaçadores entre a superfície e a molécula imobilizada, evitando efeitos de impedimento estérico, e consequentemente aumentando a capacidade de imobilização de biomoléculas (LUO et al., 2012). CARACTERIZAÇÃO DOS CRIOGÉIS A Tabela 1 mostra os valores de capacidade de inchamento, grau de expansão, fração de polímero seco e fração de macroporos após utilizar-se o método do glutaraldeído para imobilização do carboidrato modificado. A avaliação da capacidade de inchamento é uma medida da expansão da matriz do criogel, e quanto maior o seu valor, mais maleáveis são as matrizes após o inchamento e provavelmente menores pressões elas suportam (CARVALHO, 2010). O valor encontrado nesse trabalho foi de aproximadamente 16,5 quilogramas de água para cada quilograma de criogel desidratado, estando próximo ao encontrado por SAVINA et al. (2005), ao produzir criogéis supermacroporosos sem grupos funcionais imobilizados, contendo 6% de monômeros. Outra medida útil para avaliação da expansão do criogel é o grau de expansão. Tal parâmetro possui grande importância, pois fornece uma relação entre a massa do criogel seco (em condição de armazenamento) e o volume que o mesmo ocupa em condições operacionais. O valor obtido para o grau de expansão demonstrou que uma pequena massa de criogel ocupa um grande volume quando hidratado, o que reforça a natureza porosa de sua estrutura. O valor encontrado para fração de macroporos foi de 72%. Tal valor está dentro da faixa de 70% a 85% encontrado em diversos trabalhos sobre criogéis (YAO et al., 2006a, 2006b e 2007). A fração de polímero seco encontrada ao se hidratar os criogéis foi de 6%, o que demonstra a elevada capacidade que o criogel tem de armazenar água em sua estrutura.

Fonte: Dados da pesquisa.

Conclusões

Foi realizada a ativação do criogel supermacroporoso contendo 6% de monômeros utilizando o método do glutaraldeído para verificar a capacidade de ligação do criogel. A quantidade de n-acetil-D-glicosamina encontrada foi de 147,77 mg de carboidrato por g de criogel seco, correspondendo a uma elevada quantidade de carboidrato imobilizado. Foi realizado análises para verificar a capacidade de inchamento e o grau de expansão dos criogéis, com os valores obtidos comprovando a elevada capacidade de absorção que os criogéis possuem em armazenar água em sua estrutura. Foi calculado também o valor da fração de macroporos, o que comprovou a natureza macroporosa da superfície dos criogéis. Mais estudos são necessários, mas a produção e utilização dessas matrizes são promissoras para serem utilizadas em processos de purificação de macromoléculas.

Agradecimentos

Referências

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