Estudo da Interação entre Albumina Plasmática com Fármacos Antiparasitários: Benzonidazol e Metronidazol

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Físico-Química

Autores

Chaves, O.A. (UFRRJ) ; de Oliveira, C.H.C.S. (UFRRJ) ; Ferreira, R.C. (UFRRJ) ; de Barros, L.S. (UFRRJ) ; Cesarin-sobrinho, D. (UFRRJ) ; Netto-ferreira, J.C. (UFRRJ) ; Sant'anna, C.M.R. (UFRRJ) ; Ferreira, A.B.B. (UFRRJ)

Resumo

As interações entre albumina sérica humana (ASH) com BZL e MTZ foram estudadas por técnicas espectroscópicas (fluorescência e dicroísmo circular) sobre condições fisiológicas a 296 K, 303 K e 310 K. Cálculos teóricos por ancoramento molecular foram executados para complementação dos dados experimentais e dessa forma obter resultados mais precisos. Resultados experimentais demonstram associação dos nitroimidazóis com ASH no estado fundamental, tal associação é forte, espontânea, entropicamente dirigida e comandada por efeitos hidrofóbicos. Estudos por dicroísmo circular demonstram que tal associação não ocasiona perturbações significativas na estrutura secundária da albumina. Resultados de ancoramento molecular foram compatíveis com os dados obtidos espectroscopicamente.

Palavras chaves

Benzonidazol; Metronidazol; Albumina Sérica Humana

Introdução

Albumina Sérica Humana (ASH) constituinte do sistema circulatório têm diversas funções fisiológicas, incluindo a manutenção da pressão osmótica, transportadora, distribuidora e metabolizadora de diversos ligantes endógenos e exógenos (por exemplo, fármacos, metabólitos, ácidos graxos, aminoácidos e hormônios), resultando no aumento de solubilidade desses compostos no plasma, o que pode diminuir sua toxicidade, e/ou protegê-los contra a oxidação ou outro tipo de reação (CHAVES et al, p. 19526, 2015). Doença de Chagas, também conhecida como mal de Chagas, é considerada uma doença negligenciada, sendo transmitida, principalmente, por um inseto da subfamília Triatominae, popularmente chamado de bicho barbeiro. Desde 1970 o nitroimidazol, benznidazol (BZL) tem sido indicado para tratamento de pacientes na fase aguda da doença (fase que surge após a infeção, que dura em média dois meses). O índice de cura é de aproximadamente 70%, entretanto não há evidências que o mesmo traga benefícios na fase crônica. Posteriormente outro nitroimidazol, metronidazol (MTZ), começou a ser comercializado para tratamento das infecções provocadas por protozoários e bactérias anaeróbicas (CARVALHO et al, p. 460, 2016). A ligação entre fármacos e albumina sérica é um fator determinante e importante para a compreensão da interação do organismo com a droga (estudo farmacocinético), já que influencia a distribuição, excreção, metabolismo e interação com o alvo biológico (CHAVES et al, p. 176, 2016). Em ordem de analisar a interação desses dois nitroimidazóis comerciais frente a ASH, executamos análises por métodos espectroscópicos (fluorescência e dicroísmo circular), assim como por método teórico (ancoramento molecular) para fornecer dados que auxiliem no tratamento da doença.

Material e métodos

Materiais: Os fármacos antiparasitários benzonidazol (BZL) e metronidazol (MTZ) (fármacos comerciais) foram fornecidos gentilmente pela Dra Solange L. Castro, do Instituto Oswaldo Cruz - Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil. Os espectros de fluorescência no estado estacionário e dicroísmo circular (DC) foram realizados em um espectrofluorímetro Jasco modelo J-815 com cela de quartzo de 1 cm de passo ótico, equipada com sistema termostatizado Jasco PFD-425S15F. Para a realização dos estudos de ancoramento molecular, foi utilizada a estrutura da ASH, proveniente do Banco de Dados de Proteínas com o código de acesso 1N5U. As moléculas de BZL e MTZ foram construídas com o método semiempírico AM1 disponível no programa Spartan’14. O ancoramento dessas estruturas na albumina sérica foi realizado com o programa GOLD 5.2, o raio de cálculo em cada cavidade proteica de estudo por ancoramento molecular foi de 10 Å a partir do fluoróforo Trp-214. Métodos: Inicialmente registrou-se o espectro de emissão de fluorescência de uma alíquota de 3 mL de uma solução de ASH em PBS (pH = 7,4) com concentração de 1,00 x 10-5 mol/L (λexc = 280 nm) nas temperaturas de 296 K, 303 K e 310 K, de modo a obter a intensidade de fluorescência inicial (F0), sendo, em seguida, realizadas sucessivas adições de alíquotas de cada amostra (BZL e MTZ) a partir de sua respectiva solução estoque (1,00 x 10-3 mol/L em etanol), de modo a obter um valor de supressão inicial (F0-F) com aproximadamente 10% do valor inicial da fluorescência da albumina sérica (F0). [BZL] = [MTZ] = 0,56; 0,84; 1,12; 1,40; 1,67; 1,95; 2,22x10-6 mol/L. As condições utilizadas para análises de DC foram: varredura (faixa) de 200 nm a 260 nm em 310 K, com [ASH] = 1,00x10-6 mol/L e [BZL] = [MTZ] = 2,22x10- 6 mol/L.

Resultado e discussão

A supressão de fluorescência da ASH pelos fármacos, envolve um mecanismo estático, indicando associação ASH:BZL e ASH:MTZ no estado fundamental. Os valores da constante de associação de Stern-Volmer modificada (Ka) estão na ordem de 10^5 M-1 mostrando uma forte capacidade de ligação entre os nitroimidazóis e a albumina, entretanto as experiências de dicroísmo circular mostram que essa ligação não perturba significativamente a estrutura secundária da albumina (CHAVES et al, p.3031, 2016). Os parâmetros termodinâmicos, calculados a partir da equação de van’t Hoff, mostram ΔH°>0 e ΔS°>0 para a associação entre os nitroimidazóis com ASH. De acordo com a teoria de ROSS et al, p.3097, 1981, valores positivos de ΔH° e ΔS° indicam interações intermoleculares do tipo ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas entre os nitroimidazóis com os resíduos de aminoácidos presentes na cavidade proteica. Os valores negativos de ΔG°, obtidos a partir da equação livre de Gibbs, mostram a espontaneidade do processo de associação. Como, nesse caso, o valor entrópico é o fator que mais contribuiu para a obtenção da energia livre de Gibbs negativa, assumimos que a associação ASH:BZL e ASH:MTZ é entropicamente dirigida. Isso ocorre pelo efeito das moléculas de hidratação, que inicialmente encontram-se organizadas dentro da cavidade proteica e ao redor do ligante e após a associação, essas mesmas moléculas são liberadas para o meio, o que favorece o valor de ΔS° (CHAVES et al, p.175, 2016). Os resultados computacionais sugerem que o BZL interage via t-Stacking com Trp-214 e os resíduos Gln-220, Arg-221 e Gln-449 interagem via ligação de hidrogênio com os grupos polares do ligante. Em contrapartida para o MTZ, os resíduos Lys-198, Trp-214 e Glu-449 interagem via ligação de hidrogênio.

(A) Representação do melhor resultado de ancoramento molecular para associação ASH:BZL no subdomínio IIA (função ChemPLP).


(B) Representação do melhor resultado de ancoramento molecular para associação ASH:MTZ no subdomínio IIA (função ChemPLP).

Conclusões

Os estudo por supressão de fluorescência da interação entre ASH com BZL e MTZ, mostraram formação de complexo no estado fundamental, ligação forte, espontânea e entropicamente dirigida. Pelas amostras apresentarem ∆H°>0 e ∆S °>0, interagem via ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Os resultados computacionais sugerem que a cavidade da ASH onde está localizado o fluoróforo interno da proteína consegue acomodar favoravelmente os fármacos antiparasitários estudados e os estudos de dicroísmo circular, mostram que não há perturbações significativas na estrutura secundária.

Agradecimentos

Os autores gentilmente agradecem ao apoio financeira dos órgãos de fomento CAPES, CNPq e FAPERJ

Referências

CARVALHO, A. S.; MENNA-BARRETO, R. F. S.; ROMEIRO, N. C.; DE CASTRO, S. L.; BOECHAT, N. Design, Synthesis and Activity Against Trypanosoma cruzi of Azaheterocyclic Analogs of Megazol. Med. Chem. n° 3, 460-465, 2016.

CHAVES, O. A.; AMORIM, A. P. O.; CASTRO, L. H. E.; SANT'ANNA, C. M. R.; DE OLIVEIRA, M. C. C.; CESARIN-SOBRINHO, D.; NETTO-FERREIRA, J. C.; FERREIRA, A. B. B. Fluorescence and Docking Studies of the Interaction between Human Serum Albumin and Pheophytin. Molecules, n° 20, 19526-19539, 2015.

CHAVES, O. A.; JESUS, C. S. H.; CRUZ, P. F.; SANT'ANNA, C. M. R.; BRITO, R. M. M.; SERPA, C. Evaluation by fluorescence, STD-NMR, docking and semi-empirical calculations of the o-NBA photo-acid interaction with BSA. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy (Print), n° 169, 175-181, 2016.

CHAVES, O. A.; SCHAEFFER, E.; SANT'ANNA, C. M. R.; NETTO-FERREIRA, J. C.; CESARIN-SOBRINHO, D.; FERREIRA, A. B. B. Insight into the interaction between α-lapachone and bovine serum albumin employing a spectroscopic and computational approach. Mediterranean Journal of Chemistry, n° 5, 331-339, 2016.

ROSS, P. D.; SUBRAMANIAN, S. Thermodynamics of Protein Association Reactions: Forces Contributing to Stability. Biochemistry. n° 20, 3096-3099, 1981.