ESTUDO DE BIOMARCADORES NITROGENADOS DA INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔNICA: CREATININA, UREIA E AMÔNIA

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Genuncio Silva, L. (UENF) ; Gomes da Silva, M. (UENF) ; Pessanha de Castro, M.P. (UENF) ; Mansur Kuba, V. (FMC) ; Martins Santiago Neto, R. (PRORIM) ; Espécie Bueno, S.C. (UENF) ; Silva Sthel, M. (UENF) ; Mota, L. (UENF)

Resumo

Biomarcadores nitrogenados como creatinina, ureia e amônia podem indicar Insuficiência Renal Crônica (IRC) dependendo da concentração no sangue ou respiração. O objetivo geral deste trabalho foi analisar os biomarcadores da IRC, creatinina, ureia e amônia para quatro voluntários. Foram calculados o Clearance de creatinina por meio da equação de Cockcroft-Gault, e também detectou-se amônia na respiração dos voluntários aplicando a Espectroscopia Fotoacústica Gasosa. Os dois voluntários doentes exalaram maiores concentrações de amônia, exibindo níveis superiores de ureia e creatinina sanguíneas, e menores valores de Clearance quando comparados aos dois voluntários saudáveis. A pesquisa poderá contribuir com futuros diagnósticos não-invasivos da IRC por meio da detecção de amônia no hálito.

Palavras chaves

Biomarcadores; Insuficiência Renal; Fotoacústica

Introdução

A Insuficiência Renal Crônica (IRC) pode ser definida como uma doença na qual os rins deixam de filtrar adequadamente o sangue para eliminação de impurezas do corpo (BORTOLOTT, 2008). Alguns compostos químicos nitrogenados como a creatinina (C4H7N3O), ureia (CH4N2O) e amônia (NH3) podem indicar a doença dependendo de sua concentração no sangue ou na respiração, por este motivo são considerados biomarcadores (NARASIMHAN et al., 2001). O nível normal de ureia sanguínea é de 10 a 50 mg/dL. Contudo, o parâmetro mais confiável e amplamente utilizado pela comunidade médica para diagnóstico da IRC é a Taxa de Filtração Glomerular (TFG) estimada pelo cálculo do Clearance de creatinina (Cc), que determina quantos mL de sangue os rins filtram por minuto diariamente (ABENSUR, 2011; SODRÉ et al., 2007). A creatinina é uma proteína oriunda do metabolismo da creatina muscular, produzida constantemente durante o dia e filtrada livremente pelos rins. Desta maneira, o cálculo do Cc deve levar em consideração aspectos pertinentes musculatura do indivíduo como idade (anos), peso (kg) e sexo (masculino ou feminino). O nível de creatinina considerado normal no sangue é de 0,6 a 1,4 mg/dL (ABENSUR, 2011; BURMEISTER et al., 2007; NAPOLI FILHO et al., 2008). A Sociedade Internacional de Nefrologia define a IRC a partir do valor do Cc: Cc ≥ 90 mL/min desde que haja lesão renal por um período ≥ 3 meses; ou Cc < 60 mL/min com ou sem lesão renal por período ≥ 3 mêses. Sendo a função renal considerada normal desde que 90 mL/min ≤ Cc ≤ 120 mL/min sem lesão renal crônica (BASTOS et al., 2004, 2009, 2010; INTERNATIONAL SOCIETY OF NEPHROLOGY, 2013). Outro biomarcador nitrogenado bem estabelecido para IRC é a amônia. A produção de amônia pelo organismo está relacionada ao metabolismo de proteínas ingeridas na alimentação. Entretanto, como a amônia é tóxica torna-se necessário eliminá-la. Uma pequena quantidade deste composto é expelida na respiração devido às trocas gasosas entre o sangue e o ar alveolar. Sendo que o principal mecanismo de excreção é através da urina após a amônia ser convertida em ureia no ciclo da ureia hepática (BUSZEWSKI et al., 2007; RISBY; TITTEL, 2010; WOJTAS et al., 2012; WOJTAS et al., 2014; WANG; SAHAY, 2009; KIM; JAHAN; KABIR, 2012; WANG et al., 2012; LOURENÇO; TURNER, 2014). Na respiração de indivíduos saudáveis a amônia é usualmente detectável em torno de 0,25 ppmv (partes por milhão em volume). Já em indivíduos com IRC esta concentração tende a aumentar, uma vez que os rins diminuem significativamente a função de filtrar o sangue para eliminação da ureia, o que promove um desequilíbrio no ciclo da ureia hepática levando ao excesso de amônia no corpo (NARASIMHAN et al., 2001; MCCURDY et al., 2007; WANG; SAHAY, 2009; POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011b; NAVAS; JIMÉNEZ; ASUERO, 2012; TITTEL et al., 2012; WANG et al., 2012). Um método inovador que vem sendo estudado para diagnóstico e monitoramento da IRC é a detecção de amônia como biomarcador no hálito humano por meio da aplicação da Espectroscopia Fotoacústica Gasosa acoplada ao LASER de Cascata Quântica (EFG-QCL) (DUMITRAS et al., 2005; BAPTISTA FILHO et al., 2006; KOSTEREV et al., 2008; RISBY; TITTEL, 2010; TITTEL, 2012). Este método é vantajoso por possibilitar medições não invasivas, uma vez que basta coletar e medir a respiração do paciente. Ademais, a EFG-QCL apresenta baixo custo instrumental, elevada sensibilidade, seletividade e baixos limites de detecção (ppmv e ppbv) (MIKLÓS; HESS; BOZÓKI, 2001; SIGRIST, 2003). Sabe-se que no Brasil cerca de 10 milhões de pessoas apresentam IRC, e 113 mil necessitam de terapia renal substitutiva como sessões de hemodiálise (SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA, 2015; SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA, 2016). Sendo assim, justifica-se a importância de realizar pesquisas que visem quantificar amônia a nível de traço na respiração humana, uma vez que a comunidade médica pode futuramente utilizar este tipo de aplicação para auxiliar no diagnóstico precoce e estabelecer monitoramentos não invasivos da IRC. Tendo em vista este cenário, o objetivo geral desta pesquisa foi analisar os biomarcadores da IRC, ureia, creatinina e amônia para dois voluntários saudáveis (VS1 e VS2), e dois voluntários doentes (VIRC1 e VIRC2). Os objetivos específicos foram calcular o Cc utilizando a equação de Cockcroft-Gault e detectar amônia na respiração humana por meio da aplicação da EFG-QCL.

Material e métodos

Quatro voluntários participaram da pesquisa, dois saudáveis (VS1 a VS2) e dois doentes (VIRC1 e VIRC2). Solicitou-se aos mesmos que disponibilizassem um exame de sangue recente, realizado durante o período de desenvolvimento da pesquisa, a fim de que os níveis de ureia e creatinina fossem investigados. Também foi realizada uma entrevista a fim de coletar dados para o cálculo do Cc. Os valores de Cc (mL/min) foram calculados conforme a equação de Cockcroft-Gault: y = (140 – idade) x peso ÷ creatinina x 72. Sendo assim, Cc = y x 1,00 (para homens) ou Cc = y x 0,85 (para mulheres). Então, foi possível confirmar a classificação dos voluntários como saudáveis ou não, e determinar o estágio da IRC em que se encontravam (BASTOS et al., 2004, 2009, 2010; BURMEISTER et al., 2007; SODRÉ et al., 2007; NAPOLI FILHO et al., 2008). A fim de verificar se a concentração de amônia na respiração dos voluntários doentes seria maior do que nos voluntários saudáveis empregou-se a EFG-QCL, que se baseia no princípio físico de transformação de energia luminosa em energia térmica para geração de energia acústica, que é convertida no detector em um sinal elétrico denominado sinal fotoacústico diretamente proporcional a concentração da molécula de interesse (MIKLÓS; HESS; BOZÓKI, 2001; SIGRIST, 2003; BAPTISTA FILHO et al., 2006). O QCL adotado é caracterizado por ser uma fonte de radiação seletiva, uma vez que emite no infravermelho médio em torno de 1046,40 cm-1, região de absorção da amônia. Os parâmetros do QCL foram potência de 1,060 mW, duração de pulso de 30 ns e taxa de repetição de 1,5 μs. A frequência de ressonância do detector foi de 3779,5 Hz e constante de tempo de 300 ms (BAPTISTA FILHO et al., 2006). Empregou-se no experimento filtro de KOH e filtro físico de N2 líquido para eliminação respectivamente de CO2 e vapor de H2O das amostras. Realizou-se uma curva de calibração fotoacústica de amônia com a finalidade de determinar o limite de detecção do sistema. Para isso utilizou-se um cilindro de 10 ppmv de amônia certificada (White Martins) diluída em ar sintético na faixa de 4 a 0 ppmv, com fluxo total de 200 cm3/min. Para coleta da respiração foram empregadas sacolas Tedlar (Energética Ltda) de 5 L. Com VS1 e VS2 coletou-se amostras de ar em diferentes horários do dia, antes e após as refeições. Já com VIRC1 e VIRC2 a coleta foi realizada pela manhã. A coleta foi realizada com a precaução de eliminar o volume de espaço morto. A amostra foi transferida para o espectrômetro fotoacústico com auxílio de uma bomba de sucção (Low Flow Sampler – Gilian, LFS-113D) e fluxômetro de controle (ALICAT), a fim de que fossem realizados espectros experimentais variando o número de onda de emissão do LASER de 1045,9 a 1047,0 cm-1. Confrontou-se os espectros experimentais com os teórico obtidos na base de dados Hitran para assegurar a molécula detectada, e as medidas foram realizadas em triplicata.

Resultado e discussão

Sabendo que a concentração normal de ureia no sangue encontra-se entre 10 e 50 mg/dL, o voluntário VS1 apresentou 33,9 mg/dL de ureia enquanto VS2 apresentou o valor de 24,0 mg/dL em seus exames de sangue, ambos dentro da normalidade. O mesmo pode-se dizer com relação aos níveis de creatinina no sangue dos voluntários saudáveis, uma vez que os níveis normais encontram-se na faixa de 0,6 a 1,4 mg/dL, VS1 apresentou o valor de 1,03 mg/dL enquanto VS2 obteve a concentração de 0,65 mg/dL. Já para os voluntários com IRC os valores de ureia e creatinina encontram-se acima dos níveis de normalidade e foram respectivamente 69 mg/dL e 5,77 mg/dL para VIRC1, enquanto para VIRC2 foram 75 mg/dL e 6,73 mg/dL. Apenas pelas concentrações elevadas de ureia e creatinina no sangue dos voluntários já foi possível perceber que VIRC1 e VIRC2 apresentavam uma disfunção renal. Contudo, conforme mencionado anteriormente o parâmetro adequado para diagnóstico da IRC é o cálculo do Cc. Com os resultados da entrevista realizada com todos os voluntários (Tabela 1) foi possível empregar a equação de Cockcroft-Gault. É possível observar na Tabela 1 que os voluntários saudáveis apresentaram sua função renal normal, com os rins filtrando diariamente uma vazão de sangue entre 90 e 120 mL/min. Ademais, estes voluntários não pertenciam a nenhum grupo de risco para IRC como diabetes, lesão crônica nos rins, ou hipertensão. Enquanto que os voluntários doentes apresentaram valores de Cc muito baixos demonstrando claramente a IRC. Com os resultados de Cc calculados e conforme a classificação da Sociedade Internacional de Nefrologia (2013) foi possível classificar VIRC1 no quarto estágio da doença, denominado estágio severo (15 < Cc < 29 ml/min), enquanto o VIRC2 foi classificado no quinto e último estágio da doença denominado estágio terminal (Cc < 15 mL/min). Em ambos os estágios os pacientes necessitam de terapia renal substitutiva e no estágio terminal é necessário transplante de rins. Com relação ao experimento de detecção de amônia utilizando a EFG-QCL, o resultado da curva de calibração fotoacústica com amônia certificada forneceu um limite de detecção de (3,1 ± 0,2) μV que corresponde a concentração de 0,25 ppmv ou 250 ppbv de amônia. Este resultado impossibilitou a quantificação de amônia exalada pelos voluntários saudáveis, uma vez que a respiração medida em diferentes horários do dia (manhã e tarde) apresentou nos espectros uma amplitude de sinal fotoacústico inferior ao limite de detecção do sistema, isto é, uma concentração de amônia menor que 0,25 ppmv. O fato de indivíduos saudáveis exalarem amônia próximo a 0,25 ppmv é relatado na literatura como um valor de referência para diferenciar estes voluntários dos que apresentam IRC (POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011b; NAVAS; JIMÉNEZ; ASUERO, 2012; WANG et al., 2012). Para quantificar esta exalação o limite de detecção do sistema teria que ser menor, o que futuramente pode ser obtido utilizando um QCL que alcance maiores valores de potência. Verificou-se que a concentração de amônia na respiração dos voluntários doentes VIRC1 e VIRC2 foi maior que no caso dos voluntários saudáveis (< 0,25 ppmv). A média das triplicatas considerando todos os dias de medida da respiração de VIRC1 forneceu o valor de (1,1 ± 0,3) ppmv de amônia, enquanto que para VIRC2 a concentração de amônia detectada na respiração foi de (1,3 ± 0,3) ppmv. Uma vez que com os voluntários controle VS1 e VS2 foram realizadas medidas em diferentes horários do dia e não foi observada amônia detectável, é possível associar a presença de amônia na respiração de VIRC1 e VIRC2 ao fato destes apresentarem IRC em estágio avançado confirmando assim a capacidade da amônia atuar como um biomarcador. Valores de concentração de amônia associados com a IRC e pesquisados na literatura indicaram que no caso de alguns indivíduos doentes a concentração de amônia na respiração pode variar de 1,6 ppmv até 4,79 ppmv, e que estas podem ser reduzida com terapia renal substitutiva para os valores de 0,6 a 1,50 ppmv, o que demonstra que existe uma exalação característica destes indivíduos que sempre estará presente e será maior que no caso de indivíduos saudáveis (NARASIMHAN; GOODMAN; PATEL, 2001; POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011 b; WANG et al., 2012). Conforme o desvio padrão da concentração de amônia exalada por VIRC1 e VIRC2 não é possível dizer que estas concentrações sejam diferentes entre si. Contudo, a literatura sugere que para menores valores de Cc e maiores valores de ureia no sangue espera-se uma maior exalação de amônia (NARASIMHAN et al., 2001; POPA et al., 2011a). Sendo assim, pode-se dizer que existe uma tendência de VIRC2 exalar uma concentração maior de amônia, uma vez que este voluntário apresentou um valor menor de Cc (10,5 ml/min) e maior valor de ureia (75 mg/dL) quando comparado a VIRC1.




Conclusões

Esta pesquisa buscou estudar os biomarcadores nitrogenados da insuficiência renal crônica (ureia, creatinina e amônia). Conforme esperado, foi possível demostrar uma relação entre os níveis de ureia no sangue, valores de Clearance de creatinina calculados pela equação de Cockcroft-Gault, e a concentração de amônia detectada na respiração, uma vez que quanto maior o nível de ureia no sangue, maior a concentração de amônia exalada e menor o Clearance de creatinina, o que foi observado na prática. Ademais, a pesquisa contribuiu para o desenvolvimento de estudos que futuramente possam viabilizar monitoramentos e diagnósticos da IRC de maneira não-invasiva por meio da detecção de amônia no hálito humano, o que é extremamente importante porque visa minimizar o sofrimento humano proporcionado por exames invasivos. Apesar do espectrômetro fotoacústico acoplado ao LASER de cascata quântica utilizado ter apresentado limite de detecção (0,25 ppmv), inviabilizando a detecção de amônia oriunda da respiração de voluntários saudáveis, a técnica mostrou-se sensível e seletiva na detecção do referido biomarcador na exalação de voluntários com Insuficiência Renal Crônica em estágios avançados.

Agradecimentos

Os autores agradecem às instituições de fomento CAPES, FAPERJ e CNPq, universidades UENF e FMC, hospital PRORIM de Campos dos Goytacazes, e a todos os voluntários.

Referências

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