Avaliação eletroquímica da imobilização do anticorpo especifico para o câncer do ovário

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Cunha, B.D. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Alves, L.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Castro, A.C.H. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Brito-madurro, A.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA)

Resumo

Visando a aplicação de polímeros para a construção de bioeletrodos, este trabalho apresenta a comparação de duas plataformas para a imobilização de um anticorpo especifico para o câncer de ovário (anti CA-125) usando eletrodos de grafite descobertos ou modificados com ácido poli(3-hidroxibenzóico) [poli(3- HBA)]. Após a imobilização do anticorpo observou-se um aumento nos valores de corrente de pico de cerca de 1,2 vezes para os eletrodos de grafite descobertos e cerca de 1,7 vezes para os eletrodos modificados com poli (3- HBA). Portanto, a imobilização do anti CA-125 foi mais eficiente sobre os eletrodos de grafite modificados com o polímero.

Palavras chaves

Polímeros; bioeletrodos; câncer de ovário

Introdução

As pesquisas mais recentes na química de materiais aplicados a novas tecnologias concentram-se na performance de dispositivos de baixo custo, flexíveis e miniaturizados para a aplicação rápida e próxima ao paciente. Polímeros são bons materiais usados na construção de sensores, por aumentarem a área superficial, serem condutores elétricos, possuir um processamento simples e atuar como sensibilizador de superfície visando melhor imobilização da sonda (GARCÍA-ÁLVAREZ, 2008). A neoplasia do ovário é o sexto câncer ginecológico mais comum e a quarta principal causa de doenças malignas entre mulheres. Devido à falta de testes de diagnóstico adequados muitos casos são diagnosticados em estágios avançados, o que explica a elevada mortalidade (MORA PADILLA; GUTIÉRREZ RODRÍGUEZ, 2016). O marcador tumoral CA125 presente na corrente sanguínea é o principal marcador aprovado para diagnosticar e monitorar a progressão da doença e a resposta ao tratamento. Porém os testes existentes são caros, demorados, invasivos e alguns casos não conclusivos. Portanto, é crucial encontrar ferramentas de diagnóstico para detecção precoce e de recorrência, e identificar fatores prognósticos para o tratamento mais adequado e maximizar a sobrevida livre de sintomas (MAYORAL et al., 2016). Com o desenvolvimento de novas tecnologias e o baixo custo computacional, há hoje uma demanda significativa por novos sensores em busca de uma melhor precisão, baixo custo e bons resultados de análises em tempo real (SIMÕES, 2005) Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi comparar duas plataformas para imobilização de anticorpos específicos para o câncer de ovário (anti-CA125), visando o futuro desenvolvimento de um biossensor para o seu diagnóstico molecular.

Material e métodos

Os estudos eletroquímicos foram realizados em célula eletroquímica de três compartimentos acoplada a um potenciostato (CH Instruments 620C, EUA). Discos de grafite (6,15 mm de diâmetro, 99,9995% de pureza), placa de platina e cloreto de prata/prata (em KCl 3,0 mol L-1) foram utilizados como eletrodos de trabalho, auxiliar e de referência, respectivamente. Os eletrodos de grafite foram polidos mecanicamente (alumina 0,3 μm), sonicados, lavados e secos. O pré-condicionamento foi realizado em solução de HClO4 0,5 mol L-1 (0,0 e + 1,2 V vs. Ag/AgCl, 4 ciclos, 50 mV.s-1). Após o pré-condicionamento, os eletrodos foram modificados com um polímero derivado de ácido 3-hidroxibenzóico (3-HBA, 2,5 mmol L-1,10 varreduras, 0,0 e +1,2 V vs. Ag/AgCl, 50 mV.s-1). A solução da biomolécula anti-CA125 (10 µg.mL-1) (Sigma) foi diluído em tampão fosfato (0.1 mol.L-1, pH: 7,4). Para os testes de imobilização, 15 μL da solução do anticorpo anti-CA125 (10 µg.mL-1) foi gotejada sobre os eletrodos de grafite ou eletrodos de grafite modificados com polímero e mantidos a 37 ºC durante 30 minutos. Após a imobilização, os eletrodos foram lavados três vezes com 50 µL de tampão de fosfato, durante 5 segundos para remover materiais não ligados na superfície do eletrodo. Uma solução de ferrocianeto de potássio (K4Fe(CN)6, 5 mmol.L-1) e cloreto de potássio (KCl, 0.1 mol.L-1) foi utilizada nas detecções eletroquímicas, e aplicou-se a técnica de voltametria de pulso diferencial (-0,4 - +1,0 V vs. Ag/AgCl, 20 mV.s-1).

Resultado e discussão

As interações que ocorrem na superfície do eletrodo podem ser observadas monitorando as alterações na transferência de elétrons de diferentes indicadores redox. Neste trabalho, a imobilização foi monitorada usando o sinal de oxidação do ferrocianeto de potássio. A Figura 1 mostra a imobilização sobre as duas superfícies analisadas, grafite descoberto e grafite modificado com poli (3-HBA). No grafite observou-se um aumento de cerca de 1,2 vezes nos valores de corrente após a imobilização do anticorpo e para os eletrodos contendo o poli (3-HBA) houve uma diminuição de cerca de 1,7 vezes nos valores de corrente de pico. Estudos mostram que alguns resíduos de aminoácidos presentes em proteínas possuem cadeias laterais aromáticas, que são suscetíveis à oxidação (ENACHE et al., 2013). O aumento nos valores de corrente que ocorre no grafite após a imobilização do anticorpo, possivelmente ocorreu devido à presença desses aminoácidos oxidáveis que podem ter ficado retidos mais fracamente sobre a superficie. Porém no plataforma contendo o poli (3-HBA) houve uma diminuição considerável no valor de resposta, indicando que o anticorpo ficou imobilizado sobre a superficie dificultando a transferência de elétrons para o ferrocianeto de potássio. Possivelmente os aminoácidos oxidáveis presentes no anticorpo interagiram com os grupos funcionais do polímero e deste modo a biodisponibilidade desses aminoácidos ficou comprometida e os valores de corrente diminuiram devido a presença desse material na superfície.

Histograma obtido do voltamograma de pulso diferencial na presença e ausência do anticorpo sobre os eletrodos de grafite e eletrodos modificados.

Conclusões

A imobilização do anticorpo (anti CA-125) foi possivel nas duas plataformas, porém na presença do filme polimérico a quantidade de material retido sobre a superficie foi superior, evidenciado pela diminuição na amplitude de corrente. Além disso, os resultados sugerem que na presença do poli (3-HBA) ocorreu uma imobilização mais eficiente, evitando o processo de lixiviação e possivelmente aumentado a estabilidade do sensor biológico. Estes resultados são promissores para o desenvolvimento de um imunossensor para o diagnóstico do câncer de ovário.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, FAPEMIG e CAPES pelo apoio financeiro.

Referências

ENACHE, T.A.; OLIVEIRA-BRETT, A.M. Peptide methionine sulfoxide reductase A (MsrA): direct electrochemical oxidation on carbon electrodes. Bioelectrochemistry, 89, 11–18, 2013.

GARCÍA-ÁLVAREZ, J. L. Synthesis of conducting organic polymeric materials mediated by metals: how the organic chemists make some of the most advanced polymeric materials. Current Organic Chemistry. 12,1199-1219, 2008.

MORA PADILLA, E.; GUTIÉRREZ RODRÍGUEZ, E. Características de las pacientes con cáncer de ovario en el Hospital de San José, Bogotá D.C., 2009-2013. Repertorio de Medicina y Cirugía, 25, 1, 15-21, 2016.

MAYORAL, M.; FERNANDEZ-MARTINEZ, A.; VIDAL, L.; FUSTER, D.; AYA, F.; PAVIA, J.; PONS, F.; LOMEÑA, F.; PAREDES, P. Prognostic value of 18 F-FDG PET/CT volumetric parameters in recurrent epithelial ovarian cancer. Revista Española de Medicina Nuclear e Imagen Molecular (English Edition), 35, 2, 88-95, 2016.