Análise do Perfil Químico por CLAE do fungo endofítico Lasiodiplodia pseudotheobromae

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Iniciação Científica

Autores

Marques, H.P.C. (UNIFESSPA) ; Marinho, A.M.R. (UFPA) ; Silva, S.Y.S. (UNIFESSPA) ; Marinho, P.S.B. (UFPA) ; Oliveira, M.N. (UNIFESSPA) ; Silva, M.C. (UNIFESSPA) ; Silva, C.O.C. (UNIFESSPA) ; Silva, S.C. (UNIFESSPA)

Resumo

A pesquisa em produtos naturais pode ser apontada como uma das mais tradicionais sendo as substâncias oriundas dessas, muito utilizadas na medicina moderna no trato de diversas patologias. Os fungos endofíticos veem sendo muito estudados na busca por compostos biologicamente ativos. Neste trabalho, foi realizada uma curva de crescimento do fungo Lasiodiplodia pseudotheobromae isolado da espécie Morinda citrifolia, para verificar o seu crescimento e conhecer o perfil químico. Os micro-extratos foram analisados por CLAE onde foi observado que o tempo ideal de seu crescimento, para obtenção de uma maior quantidade de metabolitos foi de 15 dias. Em relação ao perfil químico foi possível inferir que a espécie fúngica produz substâncias como isocumarina, alcaloides entre outros.

Palavras chaves

Noni; Fungo; CLAE

Introdução

A pesquisa em produtos naturais pode ser apontada como uma das mais tradicionais existente. Apesar da utilização de produtos naturais ser bem antiga, os produtos naturais continuam sendo utilizados na medicina moderna no trato de diversas patologias (Lage, 2011). É provável que os produtos naturais sejam oriundos das influências mútuas de organismos entre si e destes com o ambiente. Compreende-se que os organismos vivem em interação na natureza, podendo ou não ser encontrados de forma harmônica. No que tange aos microrganismos e suas relações de sanidade com o hospedeiro, estes podem ser classificados como endofíticos, epifíticos e rizosféricos (CONTI et al 2012). Os endofíticos são reconhecidos como uma fonte rica de metabólitos bioativos com uma imensa aplicabilidade nas indústrias (BORGES, 2016; CHAPLA, 2010; PINHEIRO, 2016). O fungo endofítico Lasiodiplodia pseudotheobromae surgiu de uma separação crítica da espécie identificada por L. theobromae, sendo conhecida na África, Europa e América Latina, possuindo assim uma quantidade diversificada de hospedeiros, o qual pertencente à família Botryosphariaceae e ao gênero Lasiodiplodia (ADETUNJI & OLEKE, 2013). Entre os metabólitos secundários presentes em Lasiodiplodia são descritos o ácido jasmônico e seus derivados, alguns policetídeos, tais como a lasiodiplodina, lasiodiplinas e isocumarinas (Oliveira, 2017), as Lasiodiplinas A, B, C, D, E e F, Ciclo-(Trp-Ala) (WEI et al, 2014) e também os metabólitos Palmurumicina LP1, Cladospirona B, Ascocitatina e Sch 50676 (Oliveira, 2017). O estudo do fungo endofítico Lasiodiplodia pseudotheobromae isolado da planta Morinda citrifolia, contribuirá para verificação do perfil químico do mesmo.

Material e métodos

Para análise do perfil químico do endófito Lasiodiplodia pseudotheobromae, a linhagem foi inoculada em placas de petri, contendo o meio BDA (batata, dextrose e agar) mais o antibiótico tetraciclina. As placas foram armazenadas em câmara tipo BOD por 7 dias a 27°C. O cultivo em meio sólido foi feito em 14 erlenmeyers de 250 mL, contendo 20g de arroz (Tio João) e 10mL de água destilada, estes, foram autoclavados a temperatura de 121°C, por 45 min. à pressão de 1 atm. Após esterilizados e à temperatura ambiente, acrescentou-se fragmentos do fungo. Dois destes frascos serviram como controle. Os frascos foram armazenados em modo estático. A cada 5 dias de experimento era adicionado etanol 98% em dois 2 frascos, totalizando um período de 30 dias de experimento. Após o período de 48 horas, o material foi filtrado e concentrado em rota evaporador, obtendo-se os extratos fúngicos. Este processo foi repetido por três vezes. Ao final de 30 dias, obteve-se 6 extratos. A análise foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em um cromatógrafo Shimadzu equipado com amostrador automático e detector de arranjo de fotodiodos na região do ultravioleta e visível na faixa de 210-800 nm. Os extratos foram injetados à uma concentração de 1,5 mg/mL em coluna C18 (150mmx4,6mm de diâmetro interno, tamanho das partículas de 5μm) com uma coluna de guarda C18 (20mmx4,6mm de diâmetro interno e partículas de 5μm), em fluxo de 1mL/min. O volume injetado foi de 25μL e a temperatura da coluna foi mantida a 30°C. Foi realizado um gradiente exploratório linear, iniciando-se com MeOH/H2O 10:90 (5 min) à MeOH/H2O 90:10 (60 min). O gradiente foi retornado à concentração inicial em 5 min e mantido por mais 15 min, para o equilíbrio do sistema, antes da injeção da próxima amostra.

Resultado e discussão

Na avaliação do perfil químico dos extratos da espécie Lasiosiplodia pseudotheobromae por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência, ao longo de 30 dias de cultivo em meio sólido (arroz) pode-se observar o melhor período de produção de metabólitos. No cromatograma da Figura 1, pode-se observar que o tempo ideal de cultivo é de 15 dias, ao se comparar com os demais cromatogramas, todos obtidos com comprimento de onda de 254nm. Verifica-se neste comprimento de onda uma maior quantidade de bandas, além de se observar também um aumento na produção dos metabolitos presentes no extrato. Na análise cromatográfica por CLAE do micro-extrato da espécie, foi possível verificar também, até o momento, três bandas de média à alta intensidade com o tR de 26,84 min (UVλmáx de 212 nm, 244 nm e 311 nm) e 29,86 min (UVλmáx de 209 nm, 246 nm e 312 nm), sugerindo a presença de isocumarinas, e também outras bandas com tR de 36,34 min (UVλmáx de 208 nm, 248 nm e 268 nm) e tR de 38,53 min (UVλmáx de 208 nm e 314 nm), as quais sugerem a presença de alcaloides (NIELSEN; SMEDSGAAR, 2003).

Comparação dos cromatogramas dos extratos obtidos com 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias de crescimento da espécie Lasiosiplodia pseudotheobromae.

Conclusões

As análises dos micros extratos da espécie Lasiodiplodia pseudotheobromae, possibilitou inferir que os compostos presentes, apresentam maior absorção no comprimento de onda de 254nm e que o tempo ideal para realizar a crescimento fúngico é de 15 dias. Com relação ao perfil químico, pode-se inferir que esta de acordo com as literaturas citadas, pois já foram isoladas anteriormente desta espécie isocumarinas, alcaloides e além de outros compostos.

Agradecimentos

Agradecemos ao apoio financeiro da FAPESPA e a CAPES pela concessão da bolsa.

Referências

ADETUNJI C. O; OLOKE, J.K. Effect of Wild and Mutant Strain of Lasiodiplodia Pseudotheobromae Mass Produced on Rice Bran as a Potential Bioherbicide Agents for Weeds under Solid state Fermentation. Journal of Applied Biology & Biotechnology. Vol. 1 (02), pp. 018-023, July- Aug, 2013.

BORGES, M. S. Estudo da produção metabólica de Saccarichola sp., um fungo endofítico de Eugenia jambolana Lam. (Myrtaceae). 2016. 110f. Dissertação (Mestrado em Química). Instituto Paulista de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2016.

CHAPLA, V. M. Estudo quimico e biologico do fungo endofitico Phomopsis sp. isolado da Senna spectabilis. 2010. 174f. Dissertação (Mestrado em Química).
Instituto Paulista de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2010.
CONTI, R; GUIMARÃES, D. O; PUPO, M. T. Aprendendo com as Interações da Natureza: Microganismos Simbiontes como Fontes de Produtos Naturais Bioativos. Ciência e Cultura, São Paulo, v. 64, n. 3, p. 43-47. 2012.

LAGE, G. A. Isolamento, identificação química e bioprospecção de metabólitos secundários nas folhas de Annona crassiflora Mart. 2011. 108f. Dissertação (Mestrado em Química). Departamento de Química, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2011.

NIELSEN, K.F.; SMEDSGAARD, J. Fungal metabolite screening: database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for dereplication by standarddised liquid chromatography-UV-mass spectrometry methodology. Journal of Chromatography A, v. 1002, p. 111-136, 2003.

OLIVEIRA, F. C. Estudo químico de fungos endofíticos associados a plantas do bioma caatinga. 2017. 200f. Tese (Doutorado em Química). Centro de Ciências, Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.

PINHEIRO, E. A. A. Perfil cromatográfico e potencial químico e biológico de fungos de solo e fungos endofíticos isolados de Bauhinia guianensis e Mimosa acutistipula var. ferrea. 2016. 273f. Tese (Doutorado em Química). Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química – Universidade Federal do Pará, Belém-PA, 2016.

WEI, W.; JIANG, N.; MEI, Y.N.; CHU, Y.L.; GE, H.M.; SONG, Y.C.; NG, S.W.; TAN, R.X. An antibacterial metabolite from Lasiodiplodia pseudotheobromae F2. Phytochemistry, v. 100, p. 103-109, 2014.