Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por UPLC-MS/MS para determinação de fármacos e desreguladores endócrinos na bacia hidrográfica do rio Guandu - RJ
ISBN 978-85-85905-21-7
Área
Química Analítica
Autores
de Araujo, F.G. (UERJ) ; Coutinho, R.S. (UERJ) ; Marques, M. (UERJ) ; Martins, E.M. (UERJ)
Resumo
Neste trabalho, a cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massas (QQQ) foi utilizada para o desenvolvimento e validação do método para determninação de 11 analitos (benzofenona, dietilftalato, diazepam, trimetoprim, sulfametoxazol, levonorgestrel, 4- nonilfenol, ibuprofeno, clonazepam, bromazepam e bisfenol A). A coluna BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 μm) foi utilizada e a fase móvel foi constituída de água e metanol, ambos com 0,01% de hidróxido de amônio, numa eluição por gradiente. Para a extração, utilizou-se 1,0 L de amostra a ser elúida pelo cartucho OASIS HLB (200 mg).Para todos os analitos, obteve-se valores de R2 > 0,99, valores de incerteza menores do que 20%, boa faixa de linearidade, baixo erro padrão e bons valores de LQI e LDI.
Palavras chaves
micropoluentes; cromatografia líquida; validação de metodologia
Introdução
A água é um dos bens naturais mais importantes do planeta e vem causando grande preocupação mundial com o uso, destino e principalmente estado de degradação. Segundo a Organização das Nações Unidas para a Educação, a Ciência e a Cultura, a baixa disponibilidade de água para os mais diversos usos é um dos problemas ambientais mais grave desse século. A disponibilidade não está relacionada somente a escassez quantitativa da água em algumas regiões e aumento da demanda mundial, mas também está relacionado com a degradação de sua qualidade. Essa depreciação de qualidade dos recursos hídricos está associado dentre outros fatores, com o crescimento desordenado das cidades e das atividades antrópicas nas bacias drenantes, ocasionando ou levando ao aumento da poluição das águas superficiais e subterrâneas (REBOUÇAS, 2001; DIAS, BARROS, 2007; TUNDISI, 2008). A presença de micropoluentes presentes em concentrações da ordem de µg L, até mesmo ng L-1, tem aumentado expressivamente, e estudos nas últimas décadas abordam os riscos de ocorrência de efeitos adversos aos organismos expostos. Cresce no ramo científico, o interesse neste grupo de contaminantes emergentes ambientais que podem interferir, com a resposta natural do sistema endócrino, podendo causar alterações funcionais das células de humanos e outros animais e, assim afetar a saúde, o crescimento e a reprodução (DE SÁ SALOMÃO, MARQUES, 2014; DEZOTTI, BILA, 2007; SALVATERRA, 2009; DANIEL, LIMA, 2014; SKINNER, 2014). Vários compostos químicos naturais ou sintéticos já foram identificados com esse potencial de interferência hormonal, incluindo fármacos, defensivos agrícolas e rejeitos de indústrias químicas. Com isso, cresce a necessidade de desenvolvimento de metodologias que permitam a detecção desses compostos.
Material e métodos
Materiais: Os padrões de Diazepam, Bromazepam e Clonazepam foram adquiridos junto a Farmacopéia Brasileira e os demais padrões foram adquiridos junto a Sigma Aldrich. Metanol e Acetonitrila grau LC-MS foram adquiridos junto a J.T. Baker assim como o Hidróxido de Amônio 28-30%. Água ultrapura foi gerada com um sistema de purificação Milli-Q®. Condições cromatográficas e do espectrômetro de massas: Para o desenvolvimento do método foi utilizado o UPLC-MS/MS Waters Acquity Xevo TQD, com ionização por electrospray (ESI) nos modos negativo e positivo. A separação cromatográfica foi obtida utilizando uma coluna BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 μm). A fase móvel foi constituída de água e metanol, ambos com 0,01% de hidróxido de amônio numa eluição por gradiente, com proporção inicial de 98:2 indo até 1:99 e retorno as condições iniciais. As análises foram efetuadas a 40º C com vazão da fase móvel de 400 μL min-1. O espectrômetro de massas operou no modo de monitoramento de reação múltipla (MRM), tendo sido selecionando duas transições para cada composto, uma para a quantificação e outro para a identificação. O nitrogênio foi utilizado como gás nebulizador e argônio como gás de colisão. Metodologia: Neste trabalho a extração em fase sólida foi utilizada para extração dos analitos da matriz. Para o procedimento de extração, foram avaliados dois diferentes tipos de cartucho OASIS HLB e C18, a massa máxima eluída pelo cartucho e o volume de amostra. Para avaliar a linearidade, incerteza, coeficiente de correlação, resíduos, supressão iônica e permitir calcular o limite de detecção e de quantificação instrumental, houve a injeção de 7 replicatas de cada concentração (1,0; 5,0; 7,5; 10,0; 25,0; 50,0 µg L-1) e foram feitas as dispersões dos valores de área.
Resultado e discussão
A avaliação do melhor cartucho, da máxima massa eluída dos analitos e o
volume de amostra são mostrados na figura 1. Como apresentado na figura 1, o
cartucho OASIS HLB reteve todos os analitos, com percentual superior a 75%.
Já o cartucho C18 apresentou valores semelhantes ao cartucho OASIS HLB,
exceto para o sulfametoxazol, onde o cartucho C18 reteve 17%. Avaliou-se
também qual a massa máxima que o cartucho foi capaz de reter, bem como o
volume de amostra. Para isso, realizou-se testes em triplicatas das
seguintes soluções: 100,00 mL de uma solução 50,0 µg L-1; 250,00
mL de uma solução 50,0 µg L-1; 500,00 mL de uma solução 50,0 µg
L-1; 1000,00 mL de uma solução 10,0 µg L-1. Como as
concentrações ambientais estão na faixa de ng L-1, e o cartucho
reteve todos os analitos num percentual superior a 75% para faixas de
concentração superiores (μg L-1), definiu-se o volume de amostra
em 1,0 L, pois a massa eluída pelo cartucho nas amostras ambientais foram
menores do que as testadas. A tabela 1 ilustra alguns parâmetros da
validação. Como pode ser observado na tabela 1, o 4-nonilfenol e o
bromazepam apresentaram uma supressão iônica superior a 30%, o que
evidenciou o efeito de matriz. Desse modo, todas as soluções preparadas
foram feitas utilizando-se a matriz como diluente. Para um grupo de
analitos, a linearidade ficou entre 1,0 - 50,0 µg L-1. Para outro
grupo, a linearidade ficou entre 5,0 - 50,0 µg L-1 e para o
dietilftalato, a linearidade ficou entre 10,0 – 50,0 µg L-1.
Todas as curvas apresentaram valores de R2 > 0,99, incerteza <
20%, erro padrão <0,1037% e valores de LQI entre 1 e 10 µg L-1 e
LDI entre 0,09 e 3,97 μg L-1.
Avaliação do poder de retenção dos cartuchos em função de sua estrutura (polimérico ou apolar), volume de amostra e massa eluída pelo cartucho.
Parâmetros estatísticos da validação.
Conclusões
Os resultados mostraram boa linearidade, valores de R2 > 0,99, baixa incerteza e erro padrão. Para o 4-nonilfenol e o bromazepam, observou-se o efeito de matriz (supressão iônica > 30%). Obteve-se também LQI na entre 1,0 e 10,0 µg L-1 e LDI 0,09 e 3,97 μg L-1. Com relação a extração, o cartucho OASIS HLB apresentou maior poder de retenção superior a 75% para todos os analitos. Como as concentrações ambientais são mais baixas do que as concentrações utilizadas nos testes, permitiu-se concluir que o cartucho será capaz de reter os analitos eluindo-se 1,0 L de amostra pelo cartucho.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq, CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro e bolsas concedidas que permitem o prosseguimento do trabalho.
Referências
DANIEL, M.S.; LIMA, E.C.: Determinação simultânea de estriol, β-estradiol, 17α-etinilestradiol e estrona empregando-se extração em fase sólida (SPE) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Revista Ambiente e Água, v. 9, n. 4, p. 689-695, 2014.
DE SÁ SALOMÃO, A.L.S.; MARQUES, M. Estrogenicity and Genotoxicity Detection in Different Contaminated Waters. Human and Ecological Risk Assessment, v. 21, p. 1793-1809, 2014.
DEZOTTI, M.; BILA, D.M.; Desreguladores endócrinos no meio ambiente: efeitos e consequências. Química Nova, v. 30, nº 3, p. 651-666, 2007.
DIAS, T.F.; BARROS, H.O.M.; A gestão dos recursos hídricos no Brasil: avanços legais e a experiência pelo uso da água. In: A. S. Messias; M. R. N. Costa. (Org.). Água – Tratamentos e políticas públicas. Série Encontro das águas, n.04. Recife: UNICAP. Recife/PE, 2007.
REBOUÇAS, A.D.; Água e desenvolvimento rural. Estudos Avançados, v. 15, nº 43, 2001.
SALVATERRA, A.F.: Nanofiltração de águas superficiais contendo disruptores endócrinos. Dissertação de Mestrado. Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, 2009.
SKINNER, M.K.: Endocrine disruptor induction of epigenetic transgenerational
inheritance of disease. Molecular and Celular Endocrinology, v. 398, p. 4-12 2014.
TUNDISI, J.G.; Recursos hídricos no futuro: problemas e soluções. Estudos Avançados, v. 22, nº 63, 2008.
