DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA CASCA DE Croton palanostigma KLOSTCH.

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Produtos Naturais

Autores

Rodrigues, C.C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Natividade, M.T.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Souza, A.A.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Siqueira, L.M.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Souza, B.A.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Souza, F.B.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Brasil, D.S.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ) ; Cunha, V.A.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ)

Resumo

O presente estudo desenvolveu a analise das atividades antimicrobianas com duas cepas bacterianas gram positivas (S. aureus e B. cereus), através do Método de Difusão em Disco, utilizando o Clorafenicol como controle positivo, com a planta C. palanostigma klotzch (Euphorbiaceae), que é amplamente utilizada na medicina popular. Para desenvolvimento do trabalho foram utilizadas 6 amostras, de um total de 15 corridas que foram obtidas por Planejamento Fatorial de Box-Behnken de extrato de C. palanostigma. As amostras escolhidas foram as que apresentaram, após teste, maior concentração de Polifenois Totais. Todas as bactérias apresentaram-se susceptíveis aos extratos demonstrando que a planta utilizada possui uma boa atividade antimicrobiana, indicando seu possível uso em indústrias.

Palavras chaves

Croton palanostigma; Método de Difusão em Disc; Atividade antimicrobiana

Introdução

O hábito de utilizar plantas como medicamentos é tão antigo quanto à história da humanidade. Segundo Maciel (1997), foram os chineses há 5 mil anos atrás os primeiros a tratarem doenças infecciosas com extratos vegetais, seguidos pelos egípcios. Esses, desenvolvidos na arte de embalsamar cadáveres, experimentaram muitas plantas, muitas vezes escolhidas pelo seu aroma, baseando-se na crença de que certos aromas afastavam os espíritos das enfermidades (Pereira, 2008). A utilização de plantas como medicamento esta fundamentada em estudos etnofarmacológicos que partindo do uso tradicional e de conhecimento popular sobre as propriedades farmacológicas (antiinflamatória, analgésica, antimicrobiana, antiespasmódica, antitérmica, laxativas, entre outras) de certas drogas vegetais, indicam o potencial para desenvolvimento de novos fitoterápicos. Neste contexto as plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais, podemos utilizar para síntese de inúmeros fármacos (SCOPEL, 2005). A exploração racional do potencial das matrizes vegetais da Amazônia poderá proporcionar aplicações na produção de novos medicamentos, como substitutos de antibióticos com o objetivo de reduzir a resistência microbiana ou como aditivos em formulações alimentícias, cosméticas e sanitizantes (HARVEY, 1999; AHMAD; BEG, 2001). Devido ao aumento progressivo da resistência, a busca de novos agentes antibacterianos derivados de produtos naturais de plantas pode ser uma alternativa, por terem uma diversidade molecular muito superior àquelas derivadas de produtos sintéticos (NOVAIS et al., 2003). Nos últimos anos, muitas plantas têm sido avaliadas não somente pela atividade antibacteriana, mas também como agente modificador de resistência antibiótica, uma vez que tenha sido observado um aumento progressivo da resistência microbiana frente aos antibióticos comumente utilizados (GIBBONS, 2004). Estudos sobre o potencial farmacológico dos extratos ou compostos isolados das espécies de Croton são relevantes, tendo em vista a diversidade de usos na medicina popular tradicional ou terapias alopáticas. Pelo ponto de vista da quimiotaxonomia, a grande variedade de compostos encontrados nessas plantas pode prover também características diagnósticas de determinados grupos ou espécies. A diversidade inerente ao gênero se reflete na descoberta de novas estruturas como, por exemplo, novas classes de diterpenos (HELUANI et al., 2000) e alcalóides (ARAUJO JUNIOR et al., 2005). O Croton Palanostigma Klozch é uma planta ainda pouco conhecida, mas que por alguns estudos realizados tem demonstrado que a mesma apresenta algumas características que auxiliam na cura de algumas doenças, por este motivo, buscou-se realizar um trabalho que viabilize um maior conhecimento desta espécie que permita principalmente contribuir para identificação de novas substâncias com atividades biológicas definidas. Contudo, a aplicação destes extratos vegetais deve ser precedida de estudos que avaliem fatores como: identificação, isolamento, toxidade e a eficácia do princípio ativo, formas de aplicações a nível industrial (BRAZ-FILHO, 1999). As bactérias são seres procarióticos com organização relativamente simples, que se reproduzem por divisão assexuada. Esses microrganismos são formados por diversas estruturas, que diferem de uma espécie para outra (MURRAY et al., 2000). De acordo com as características da parede celular, as bactérias podem ser classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas. As diferenças entre esses grupos são baseadas principalmente nas suas propriedades de permeabilidade nos componentes de superfície (JAY, 2005). Assim, serão foco deste estudo as bactérias Gram-positivas Bacillus cereus e Staphylococcus aureus. A atividade antimicrobiana pode ser determinada in vitro através de dois métodos principais: diluição para determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e/ou de difusão em disco para determinar a susceptibilidade antimicrobiana (ALVES et al.,2008).

Material e métodos

2.1- Processo de Extração Os extratos da planta C. palanostigma foram doados por Mcs Tatiane Damasceno. A extração sólido-líquido foi realizada no Laboratório de Produtos Naturais – LEPRON - localizado no Laboratório de Engenharia Química da Universidade Federal do Pará. Para isso, foi utilizado um extrator encamisado, de aço inoxidável, de escala laboratorial (Ruhrwerk), acoplado a um banho termostático de circulação de fluido (HAAKE), e um sistema de resfriamento, composto por um condensador ligado a um banho criostático, e um termômetro para mensurar e controlar a temperatura interna no referido reator. 2.2- Determinação da Atividade Antimicrobiana dos extratos Para testar a atividade antimicrobiana dos extratos, foi utilizado o método de difusão em disco de acordo com o proposto pela National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCLLS-2006) com diluição do inóculo em meio semi-sólido. Os microrganismos utilizados foram o Bacillus cereus ATCC 11778 e Staphylococcus aureus ATCC 6538. Estas cepas bacterianas Gram positivas foram adquiridas da empresa Interlab – Distribuidora de Produtos Científicos Ltda, São Paulo/SP, Brasil e padronizadas e distribuídas pelo American Type Cell Collectin (ATCC, Manassas/VA/USA). Para se verificar o grau de pureza das cepas foi realizado a Técnica de Coloração de Gram, onde foi verificado que as mesmas não estavam contaminadas. 2.3- Ativação das cepas Para isolar as colônias foram utilizados meios de cultura seletivos para cada cepa e incubados a temperatura e tempo ideal para o crescimento de cada microorganismo. As respectivas bactérias foram mantidas em Brain Heart Infusion (BHI) conservados sob refrigeração (4 °C), sendo repicados em intervalos de 05 a 10 dias para manutenção viável das colônias. As cepas bacterianas foram transferidas para tubos contendo 4 mL BHI (Brain Heart Infusion) e incubadas a 36 ºC por 24 h. Ao completar o tempo de incubação, cada inoculo se encontrava com uma densidade microbiana diferente, de acordo com o tipo de microorganismo. Para padronizar os inóculo, utilizou-se a Escala de McFarland com de 0,5 de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL.) (NCCLS, 2006). 2.4- Preparo dos Extratos para o Método de Difusão de Discos Os extratos foram neutralizados com NaOH 1N, a fim de garantir que a acidez não agisse como inibidor de atividade antimicrobiana, fazendo com que os resultados obtidos fossem falso positivos. 2.5- Teste de Difusão de Discos O potencial antimicrobiano dos extratos brutos foi avaliado através do método de difusão em disco, de acordo com o descrito pela CLSI (2006) com modificações e em triplicata. Foram utilizados como controles positivos de referência discos padronizados contendo o antibiótico clorafenicol (30 µg). A medição dos halos de inibição (mm) foi realizada com auxílio de um paquímetro. A porcentagem de inibição de cada amostra é o resultado da relação do halo de inibição da amostra com o halo do controle positivo (antibiótico).

Resultado e discussão

3.1- Atividade Antimicrobiana A atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do ensaio experimental do C. Palanostigma Kl foi avaliada quantitativamente pela presença ou ausência de halo de inibição. Após as análises, os resultados obtidos foram que todas as amostras apresentaram halo de inibição frente a todas as bactérias estudas, e as que apresentaram os melhores resultados, ou seja os maiores halos de inibição foram as amostras 10,11 e 12, diante da matriz experimental podemos perceber que ambas foram extraídas a temperatura de 40°C, isto pode indicar que extratos obtidos a esta temperatura podem apresentar as maiores atividades antimicrobianas, já que esta variavel é um fator que pode causar deteriorização do material, sendo que cada espécie de planta possui uma temperatura mínima, máxima e ótima para serem manipuladas. A Tabela 1 apresenta os valores dos halos de inibição em mm dos extratos selecionados e dos controles positivos frente as bactérias estudadas: TABELA 1 AS= SEM ATIVIDADE Podemos encontrar na literatura vários estudos sobre atividade antimicrobiana e dentre eles estudos realizados com óleos essencial do C. blanchetianus na concentração de 10%, este apresentou-se mais eficaz contra o B. cereus (ANGELICO, 2011), enquanto que o extrato do C. palanostigma Kl na concentração de 333,33 mg/L, apresentou maior atividade não só para o B. cereus como também para todas as bactérias estudadas. Já ARAUJO após alguns estudos verificou que o extrato bruto da folha do C. urucurana não possui nenhuma atividade frente as bácterias S. aureus , já o extrato do caule do C. Palanostigma Kl apresentou halos de inibição para as mesmas cepas. No entanto, Araujo, Degen e González, (2008) detectaram atividade antibacteriana do extrato hidroalcoólico (tintura) a 10% de folhas da mesma planta contra um isolado clínico de S. aureus. Esses resultados sugerem que a atividade do extrato pode ser altamente influenciada pelo solvente utilizado durante e extração, época e lugar da coleta e pelas variações existentes entre linhagens de uma mesma espécie de microrganismo utilizado para testar a atividade. A partir dos halos de inibição dos extratos vegetais e dos controles positivos (Tabela 1) determinou-se a porcentagem de inibição (TABELA 2), dos extratos frente os microrganismos, calculada através da relação dos halos de inibição das amostras com os halos dos controles positivos (3) (Tabela 2). TABELA 2 % inibição = (média do halo de inibição(EX)/ média do halo de inibição (CP) média do halo de inibição (CP))x 100 (1) A. Zona de inibição ≥ 75%: ativo; B. Zona de inibição ≥25% e < 75%: moderadamente ativo; C. Zona de Inibição < 25%: inativo. Observando os dados de porcentagem de inibição percebeu-se que cada amostra se mostrava mais eficaz em relação a determinada bactéria, por exemplo a amostra 2 e 12 foi mais ativa para o B. cereus, e amostra 6 para a S. aureus. Estudos mostram que a atividade antimicrobiana pode estar ligada ao solvente utilizado para a obtenção do extrato da casca do C. palanostigma, que para este caso foi o acetato de etila que extrai compostos com baixa polaridade dentre eles o metil-eugenol, que apresenta um alto poder antimicrobiano (BRASIL et al,. 2009). O C. palanostigma Kl possui em sua composição química vários compostos que possuem alto poder antimicrobiano, como diterpenos, flavonoides, cordatina, aparisthmano, que podem influenciar na atividade antimicrobiana.

Valores dos halos de inibição em mm


Porcentagem de inibição dos micro-organismos em estudo de controle positivo com clorafenicol 30µg

Conclusões

Todas as amostras selecionadas para análises antimicrobianas apresentaram atividade antimicrobiana, sendo que cada uma apresentou-se de forma especifica frente as bactérias Gram-positivas, esse resultado pode ser consequência da variação dos parâmetros que poderiam influenciar no processo de extração e também das compostos químicos presentes na composição fitoquímica da planta. Outra característica marcante é que as amostras atuaram como o antibiótico clorafenicol frente às linhagens das cepas estudadas. Como todas as amostras avaliadas apresentarem atividade inibitória frente as linhagens patogênicas testadas, podemos afirmar que esses resultados são promissores e indicam que os mesmos são uma fonte de produtos naturais que possuem atividade antibacteriana oferecendo dessa forma, uma importante contribuição para ampliar o conhecimento biológico das espécies, possibilitando desta forma seu possível uso em produtos como fármacos na industria farmacêutica.

Agradecimentos

Referências

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