Síntese de hidroxiapatitas dopadas com nióbio aplicadas como agente antimicrobiano

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Materiais

Autores

Araújo, R.C. (UFPB) ; Fonseca, M.G. (UFPB) ; Castellano, L.R.C. (UFPB) ; Silva, C.F. (UFPB)

Resumo

A hidroxiapatita é uma das biocerâmicas mais utilizadas para aplicações biotecnológicas, porém, possui uma resistência mecânica baixa. Desta forma, a dopagem de sua estrutura tem sido uma alternativa. Neste trabalho, hidroxiapatitas dopadas com nióbio em concentrações de 1 a 10% em mol foram obtidas por co-precipitação, utilizando o oxalato amoniacal de nióbio como fonte de Nb. Os materiais obtidos foram caracterizados por difratometria de raios-X, fluorescência de raios X e espectroscopia Raman. Foi avaliada a ação antibacteriana do sólido contendo 10% Nb(V) frente a bactéria Staphylococcus aureus e constatou-se uma concentração inibitória mínima de 50 mg/mL, concluindo que além de possibilitar o aumento da resistência mecânica, o Nb(V) conferiu uma característica bactericida ao material

Palavras chaves

Hidroxiapatita; Nióbio; Dopagem

Introdução

A perda de um órgão ou de alguma parte do corpo gera inevitavelmente, alguma limitação ou até mesmo a perda de alguma função, além de possíveis transtornos sociais e ou psicológicos. Frente a esta situação, os avanços nas pesquisas relacionadas a área da saúde vêm demonstrando resultados promissores para o desenvolvimento de biomateriais cada vez mais sofisticados, que visam restabelecer as funções totais ou parciais de algum órgão ou tecido, acometido por acidentes ou patologias (Lu et al, 2018). Dentre os fosfatos de cálcio, a hidroxiapatita (Hap) é um dos biomateriais que mais se destaca nas aplicações médico-odontológicas, em virtude de sua semelhança com a fase mineral de ossos e dentes, exibindo várias características benéficas como a biocompatibilidade, osteocondutividade e a bioatividade, favorecendo a adesão/proliferação de fibroblastos e osteoblastos, apresentando-se como um biomaterial extremamente interessante (Souza et al, 2016). Porém, por se tratar essencialmente uma cerâmica, a Hap possui uma resistência mecânica relativamente baixa quando comparada ao tecido ósseo, principalmente quando se refere a sua natureza frágil e a baixa tenacidade à fratura (Ramesh et al, 2012). Desta forma, visando melhorar suas propriedades mecânicas, alguns métodos de reforço microestrutural vêm sendo aplicados, a exemplo da dopagem e da formulação de compósitos, possibilitando assim a obtenção de materiais com propriedades biológicas adequadas, associada a uma maior resistência mecânica, podendo assim ser utilizado em regiões susceptíveis a altas cargas. Neste enfoque, a dopagem da hidroxiapatita foi o método de reforço estrutural utilizado neste estudo. Já é bem estabelecido na literatura que a modificação deste biomaterial possibilita um sinergismo entre as suas propriedades e as da espécie dopante, originando assim um produto final com propriedades biológicas apropriadas par a aplicações em tecidos ósseos, associado a uma maior resistência mecânica, o que viabiliza sua aplicação em uma maior quantidade de especialidades médicas. Dentre as várias espécies que podem ser utilizadas para modificar a estrutura da Hap, o nióbio foi escolhido, devido a sua elevada resistência mecânica, rica química redox, e por ser um material abundante em solo nacional, sendo o Brasil detentor das maiores reservas mundiais de nióbio, representando cerca de 98,2% (Brasil, 2015), o que situa o Brasil numa posição estratégica, perante sua utilização nas mais diversas áreas que são da siderurgia até a área médica. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi de obter Hap dopada com nióbio, possibilitando a utilização deste material em segmentos ósseos que demandem uma maior resistência mecânica, além de avaliar a ação bactericida frente a linhagem bacteriana Staphylococcus aureus.

Material e métodos

A síntese da Hap foi realizada por co-precipitação, partindo do gotejamento simultâneo das soluções aquosas de hidrogenofosfato de diamônio a 0,09 mol/L e do cloreto de cálcio a 0,15 mol/L, mantendo a razão Ca/P = 1,67 e pH =10. Ao final da adição dos precursores de cálcio e fósforo, o precipitado foi envelhecido sob agitação a 100 rpm a temperatura ambiente por 24 h. Em seguida, o sólido resultante foi lavado, por filtração simples, com a utilização de água deionizada. Posteriormente, o material foi encaminhado para secagem em estufa a 100ºC por 24 h. Para o processo de modificação com nióbio, foram elaboradas 5 proposições variando-se a quantidade de nióbio (1 - 10% em mol), em relação a quantidade de cálcio presente nos sólidos. Para a síntese dos materiais dopados, seguiu-se o mesmo procedimento realizado para a síntese da Hap, diferindo apenas na adição do precursor de nióbio, o qual foi adicionado na solução do hidrogenofosfato de diamônio, e só então fez-se o gotejamento simultâneo da solução de cloreto de cálcio e da solução do hidrogenofosfato de diamônio contendo os íons de nióbio. Ao final da etapa de adição dos precursores, seguiu-se os mesmos procedimentos adotados para a Hap. Após a etapa de síntese, os sólidos foram caracterizados utilizando a Difração de raios X, utilizando um difratômetro da marca Shimadzu, modelo Lab X/XRD-6000, Espectroscopia Raman, através de um espectrômetro da marca Renishaw, modelo inVia Raman Microscope, e Fluorescência de raios X, com um espectrômetro da marca Shimadzu, modelo XRF-1800. Os teste antimicrobianos envolveram a preparação de um inóculo, em que foram colhidas duas colônias da cultura em placa de ágar com ajuda de uma alça de platina devidamente flambada. Em seguida, as colônias foram inoculadas em 5 mL de meio caldo Brain Heart Infusion contidos em tubo falcon estéril de 15 mL. Após homogeneização em agitador do tipo vórtex, o inóculo foi colocado em estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 h até obter a turbidez necessária. Após esta etapa foi feita a padronização da densidade microbiana de acordo com a escala de McFarland em um espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 620 nm. Após a padronização da concentração, foi utilizada a técnica de macrodiluição, onde os sólidos foram colocados em tubos eppendorf de 2 mL, onde cada um continha 100, 50, 25, 12,5 e 6,125 mg de sólido. Em seguida foi adicionado 0,9 mL de meio de cultura e 0,1 mL da solução do inóculo em cada um dos tubos. Posteriormente, os eppendorfs foram colocados em estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 h. Após a incubação, 0,01 mL do sobrenadante foi retirado e diluído em série 4x (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4). Em seguida as diluições foram inoculadas (espalhando verticalmente, horizontalmente e diagonalmente) em placas de Petri contendo BHI agar. As placas foram incubadas novamente por mais 24 h à 37 °C e, posteriormente, foi realizada a contagem de colônias, afim de determinar a concentração inibitória mínima.

Resultado e discussão

Os padrões de difração para as hidroxiapatitas modificadas foram indexados de acordo com carta cristalográfica JCPDS 09-0432, em que foi possível observar que todos os sólidos obtidos conservam os picos característicos da hidroxiapatita, porém a entrada de nióbio na estrutura cristalina, provocou uma redução na intensidade e alargamento dos picos, além de pequenos desvios para maiores ângulos, que pode ser decorrente do tamanho das espécies, pois como o raio iônico do nióbio (V) (0,069 nm) é menor do que o cálcio (0,106 nm), haverá uma contração na estrutura. A partir dos difratogramas, foram calculados os parâmetros de rede da célula unitária, e observou-se que os valores do parâmetro a, variam aleatoriamente, independentemente da porcentagem de nióbio adicionada. Já o parâmetro c apresenta reduções consecutivas, mediante o aumento da quantidade de nióbio inserida, o que também foi observado por Capanema et al (2015). De forma análoga os valores obtidos para o volume das células unitárias também sofrem decréscimo mediante o aumento da quantidade de nióbio inserido na rede, o que é coerente com a ideia da contração da estrutura da Hap, devido a inserção de uma espécie que possui um menor raio iônico, o que também foi observado em uma pesquisa recente, que propôs a modificação estrutural da Hap utilizando íons Ta5+, que é quimicamente parecido com o nióbio, e também apresenta um raio iônico muito similar (Baradaran et al., 2018), evidenciando assim o processo de dopagem. Raman A partir dos espectros obtidos, observa-se que a hidroxiapatita apresentou picos característicos de sua estrutura, localizados em 961 cm-1 atribuído ao estiramento simétrico (P–O), em 430 e 450 cm-1 atribuídos a deformação simétrica (O-P-O), em 578, 590 e 609 cm-1 atribuídos a deformação assimétrica (O-P-O), e em 1047 e 1075 cm-1 atribuídos ao estiramento assimétrico (P–O) (Ciobanu et al., 2012). Para sólidos modificados com ambos os precursores de nióbio, é possível observar em seus espectros todos os picos observados para a Hap, além do surgimento de um ombro largo, na região que vai de 800-900 cm-1, principalmente para os sólidos modificação com 10% de nióbio, o que possivelmente é atribuindo a unidades octaédricas de NbO6 (Souza, 2018), porém este fato só pode ser confirmado por técnicas de caracterização mais sofisticadas, que ainda não dispomos no momento. Fluorescência de Raios X A partir resultados obtidos, foi possível evidenciar a presença do nióbio, em todos os sólidos elaborados, corroborando assim com os dados de difratometria de Raios-X. É observado ainda que a modificação estrutural possibilitou a obtenção de um valor da razão (Ca+Nb)/P, próximo ao da hidroxiapatita estequiométrica (Ca/P = 1,67), o que pode indicar que a inserção de nióbio proporciona poucos defeitos estruturais na Hap. Avaliação Bacteriana Para a avaliação da atividade bacteriana frente a Staphylococcus aureus, foi utilizada a hidroxiapatita modificada com 10% de nióbio. Os ensaios realizados mostraram uma concentração inibitória mínima para de 50 mg/mL, (Figura 1).

Ensaio bacteriano da hidroxiapatita dopada com Nb (V)p frete a S. aureus.

Conclusões

A partir das caracterizações realizadas, conclui-se que a estrutura da hidroxiapatita foi dopara com Nb(V), porém, as técnicas utilizadas ainda não fornecem evidências sobre o sitio ocupado pelo nióbio, necessitando assim de técnicas mais sofisticadas, que possibilitem uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processo de dopagem. A inserção do nióbio(V) na estrutura da hidroxiapatita, possibilitou o surgimento de uma ação bacteriana frente a Staphylococcus aureus, que não está presente no material de partida.

Agradecimentos

A Capes, FINEP, NPE LACOM, UFPB e LABMIC

Referências

Baradaran, S.; Nasiri-Tabrizi, B.; Shirazi, F. S.; Saber-Samandari, S.; Shahtalebi, S.; Basirun, W. J. Wet chemistry approach to the preparation of tantalum-doped hydroxyapatite: Dopant content effects. Ceramics International Vol.44(3), pp.2768-2781, 2018.
Brasil. Departamento Nacional De Produção Mineral. Sumário Mineral. 2015. Disponível em: http://www.dnpm.gov.br/dnpm/sumarios/sumario-mineral-2015. Acesso em Acesso em 20/08/2019.
Capanema, S. V. N.; Mansur, A.; Carvalho, M. S.; Silva, A. R. P.; Ciminelli, V.; Mansur, H. S. Niobium-Doped Hydroxyapatite Bioceramics: Synthesis, Characterization and In Vitro Cytocompatibility. Materials. Vol.8, p.4191-4209, 2015.
Ciobanu, C. S.; Massuyeau F.; Constantin, L. V.; Predoi, D. Structural and physical properties of antibacterial Ag-doped nano-hydroxyapatite synthesized at 100°C. Nanoscale Res Lett; Vol.6(1), p.613-620, 2011.
Lu, J.; Yu, H.; Chen, C. Biological properties of calcium phosphate biomaterials for bone repair: a review. Royal Society Of Chemistry. Vol.8, p.2015-2033, 2018.
Ramesh, S.; Tan, C. Y.; Yeo, W. H.; Tolouei, R.; Amiriyan, M.; Sopyan, I.; Teng, W. D. Effects of bismuth oxide on the sinterability of hydroxyapatite Ceram. Int. vol.37, p.599-606, 2011.
Souza, D. F. M.; Correa, L.; Sendyk, D. I.; Burim, R. A.; Naclério‐Homem, M. G.; Deboni, M. C. Z. Efeito adverso do beta‐fosfato tricálcico com controle de potencial zeta no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos. rev bras ortop. Vol.51(3), p.346–352, 2016