ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: ESTUDO METALOPROTEÔMICO DE ZINCO NO PLASMA DE TILÁPIA DO NILO
AUTORES: MACHADO, A.U. (UNESP - IBB) ; CARVALHO, T.S. (UNESP - IBB) ; CAVECCI, B. (UNESP - IBB) ; SANTOS, F.A. (UNESP - IBB) ; MORAES, P.M. (UNESP - IBB) ; NEVES, R.C.F. (UNESP - FMVZ) ; LIMA, P.M. (UNESP - FMVZ) ; PADILHA, P.M. (UNESP; INCT)
RESUMO: Objetivou-se investigar a presença de zinco em spots protéicos do plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE). Para a avaliação quali-quantitativa utilizou-se fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de zinco em seis spots protéicos de plasma. Observou-se que os íons metálicos estão ligados a proteínas com massa molar de 30 a 70 kDa e com pI entre 4,70 e 6,30. A concentração de zinco ligado a essas proteínas foi determinada por GFAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos, encontrando-se concentrações de 2,30 a 13,90 mg g-¹.
PALAVRAS CHAVES: proteínas, nutrição de peixes, 2d-page.
INTRODUÇÃO: Estima-se que aproximadamente 40% de todas as proteínas dos organismos vivos necessitam de um metal/metalóide para apresentar atividade biológica (SA et al., 2004). Dentre os elementos que apresentam forte ligação às proteínas, mais freqüentemente, estão os metais de transição, como ferro, cobre, cobalto, zinco, entre outros (SA et al., 2004). O estudo das metaloproteínas presentes em diferentes tecidos de peixes poderá trazer informações importantes para a área de fisiologia e genética desses animais. Estudos quali-quantitativos do zinco em proteínas do sangue e dos tecidos dos organismos são importantes em relação à concentração relativa desse elemento para manter a atividade de diversas enzimas, como por exemplo, a desidrogenase alcoólica (GARCIA et al., 2005; SA et al., 2005). Com base no exposto, o presente trabalho teve como objetivo mapear e quantificar zinco em spots protéicos de amostras de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), separadas por 2D-PAGE, utilizando fluorescência de raios-X (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica (GFAAS).
MATERIAL E MÉTODOS: As amostras de plasma foram separadas do sangue por centrifugação em centrífuga refrigerada e tratadas com kits para remoção de albumina. Posteriormente, as proteínas presentes na amostra foram precipitadas com acetona na proporção 1:4. Os precipitados foram solubilizados em tampão específico e aplicados em fitas de IOF com gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados (pH 4 a 7). Depois de hidratadas por 12 h as fitas foram levadas ao sistema de IOF para corrida em primeira dimensão. Após essa etapa, as fitas foram equilibradas em tampão específico por 15 minutos e aplicadas em géis de poliacrilamida a 10% m/v juntamente com padrões de massa molar, para corrida em segunda dimensão. Ao término das etapas de separação (feitas em triplicata), os spots protéicos foram fixados no gel e corados com Coomassie Blue. Em seguida, os spots foram recortados do gel e secos com lâmpada infravermelha para análise por SR-XRF com feixe de 500 µm, com leitura em dois pontos do spot e tempo de 200 segundos. Finalmente, os spots que apresentaram zinco foram submetidos à mineralização ácida para posterior quantificação por GFAAS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: As análises dos espectros de fluorescência obtidos por SR-XRF indicaram zinco em seis spots protéicos com massas molares de 31,50; 24,80; 51,50; 52,80; 64,40 e 70,00 kDa; e ponto isoelétrico igual a 4,70; 5,50; 5,30; 6,30; 4,90 e 5,80 respectivamente. A Figura 1 apresenta como exemplo, um dos espectros de fluorescência obtidos nas análises por SR-XRF dos “spots” protéicos das amostras de plasma. Além de zinco, observa-se a presença de fósforo, um não-metal que pode estar presente na estrutura da proteína do spot analisado. Outros íons metálicos detectados foram cálcio, manganês e cobre. A presença de mais de um íon metálico/metalóide em spots de proteínas é aceitável, já que única metaloproteína ou proteína ligada a metal pode ter vários sítios ativos formados por átomos de íons de diferentes elementos (SUSSULINI et al., 2007). Na Tabela 1 estão sumarizados os valores das massas molares, pontos isoelétricos e concentrações de zinco. Com base nas concentrações de zinco determinadas nos spots protéicos foi possível calcular o número de moléculas de proteínas e o número de átomos zinco por spots protéicos, resultados também apresentados na Tabela 1.
Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que os spots apresentam proteínas com massa molar menor que 70,0 kDa e pI entre 4,70 e 6,30. Com base nas concentrações de zinco nos spots protéico é possível estimar a proporção de zinco por molécula de proteína. Por exemplo, pode-se inferir que no spot 3P da amostra de plasma cada molécula de proteína tenha aproximadamente três átomos de zinco. Utilizando-se esse raciocínio, pode-se inferir que os spots 16P, 18P e 19P apresentam dois átomos de zinco e os spots 6P e 21P apenas um átomo, aproximadamente.
CONCLUSÕES: A utilização da eletroforese 2D-PAGE no estudo de avaliação de metaloproteínas foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes no plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). A boa correlação obtida nas repetições dos géis indicou que os procedimentos de extração de proteínas totais preservaram a estrutura metal-proteína, o que possibilitou o mapeamento de zinco nos spots protéicos por SR-XRF e posterior quantificação desse elemento por GFAAS. Os resultados permitiram estimar que as proteínas analisadas apresentam proporções de um a três átomos de zinco por molécula de proteína.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: GARCIA, J.S.; MAGALHÃES, C.S.; ARRUDA, M.A.Z. 2006. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, 69: 1-15.
SA, M.V.C.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA, P.M. 2004. Apparent absorption of zinc from supplemental inorganic and organic sources to Nile tilapia Oreochromis niloticus juveniles. J. World Aquacult. Soc. 36: 375-383.
SA, M.V.C.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA, P.M. 2005. Relative bioavailability of zinc in supplemental inorganic and organic sources for Nile tilapia Oreochromis niloticus fingerlings. Aquacult. Nutr. 11: 273-281.
SUSSULINI, A.; GARCIA, J. S.; ARRUDA, M. A. Z. 2007. Microwave-assisted decomposition of polyacrylamide gels containing metalloproteins using mini-vials: An auxiliary strategy for metallomics studies. Analytical Biochemistry, 361: 146-148.
