ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: REATIVIDADE DA BILE BOVINA E DA BILIRRUBINA FRENTE A RADICAIS ABTS-
AUTORES: RIBEIRO, A. C. F. F. W. (UNIFESP) ; SIQUEIRA, B. M. (UNIFESP) ; UJO, B. M. (UNIBAN) ; FILHO, E. M. (UNIFESP) ; MERCURI, L. P. (UNIFESP) ; VAUTIER-GIONGO, CAROLINA (UNIFESP) ; RETTORI, D. (UNIFESP)
RESUMO: A bile é um fluido produzido pelo fígado para atuar na emulsificação de gorduras e na absorção eficiente de substâncias nutritivas da dieta, como os lipídios, pelo intestino (Mammana, 1981 e Devlin, 2003). A coloração da bile é dada por pigmentos como a bilirrubina (BR) e a biliverdina (BV), os quais, durante muito tempo, foram considerados produtos tóxicos do metabolismo heme de animais superiores (Mammana, 1981). Entretanto, há estudos que mostram que ambos os pigmentos, principalmente a BR, são capazes de reagir com espécies radicalares, atuando como antioxidantes citoprotetores (Maghzal et all, 2009). Este trabalho apresenta investigações sobre a reatividade da bile bovina e da BR frente a radicais livres estáveis ABTS-, que indicam que a bile bovina apresenta atividade antioxidante e que a BR contribui de forma significativa para essa atividade.
PALAVRAS CHAVES: bile bovina, bilirrubina, reatividade,
INTRODUÇÃO: A bile é um fluido isotônico, com pH cerca de 7,8, cuja composição envolve ácidos biliares, lecitina, colesterol, os pigmentos bilirrubina (BR) e biliverdina (BV), proteínas, sais de potássio, cálcio e magnésio, além de outros compostos (Mammana, 1981). É produzida pelo fígado para atuar na digestão de gorduras e na absorção de substâncias como lipídios (Mammana, 1981 e Devlin, 2003). A bile apresenta coloração amarelo-esverdeada, principalmente devido à presença de BR e BV.
A BV é proveniente de algumas vias, como a da destruição de glóbulos vermelhos do sangue. Quando as hemácias são degradadas, o ferro e a globina são removidos, o anel é aberto e convertido em BV que é verde. A BV, sob ação da biliverdina redutase, é reduzida a BR, que é amarela (Small, 1968). Há estudos que mostram que ambos os pigmentos, principalmente a BR, são capazes de reagir com espécies radicalares, atuando como antioxidantes (Maghzal et all, 2009).
Quando algum componente da bile sofre alterações em seu teor ou natureza química, pode haver a formação de micro-cristais, denominados cálculos biliares, que estão presentes em 10 a 20% dos adultos entre 35 e 60 anos ao redor do mundo, sendo predominantes em mulheres (Mercuri, 2000).
Em humanos, a formação de cálculos deve-se principalmente à precipitação de colesterol, proveniente da dieta, mas bovinos não ingerem de alimentos que induzem a formação do colesterol. Portanto, estudos sobre a formação de cálculos em bovinos pode fornecer informações úteis para o desenvolvimento tratamentos para humanos.
Pretende-se estudar a reatividade da bile bovina e da BR frente a radicais livres estáveis ABTS para, num futuro próximo, estabelecer se há alguma relação entre a precipitação de cálculos biliares e processos de estresse oxidativo.
MATERIAL E MÉTODOS: Sal de diamônio de ânions 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiozolino)-6-sulfônico (ABTS, 98% Sigma), bilirrubina (BR, 98% Sigma-Aldrich) e dióxido de manganês (MnO2, >90% Sigma) foram utilizados como recebidos. A amostra de bile bovina utilizada nos experimentos é proveniente de uma fêmea de uma fazenda localizada na região de Franca-SP. A bile foi armazenada a temperaturas inferiores a 0°C, em frasco âmbar. Os radicais livres estáveis ABTS●- foram preparados a partir de uma solução estoque de 2 mM em tampão fosfato (PB) 20 mM (pH 7,4), pela da oxidação dos ânions ABTS com MnO2.
A determinação da reatividade da bile bovina e da BR frente aos radicais estáveis ABTS●- foi feita a partir de estudos cinéticos, onde a diminuição da absorbância em 734 nm, característica da presença de radicais ABTS●-, foi monitorada em função do tempo, empregando um espectrofotômetro UV-vis Varian, modelo Cary 50. A BR foi adicionada aos sistemas a partir de uma solução estoque 0,02 mmol/L em acetonitrila.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A Figura 1(A), que consta em anexo, apresenta curvas de decaimento do radical ABTS;- frente à bile bovina. A absorbância em 734 nm decai com o aumento da quantidade de bile bovina, indicando claramente que a bile é capaz de reduzir radicais livres ABTS;-, que desaparecem de acordo com um decaimento exponencial de segunda ordem, durante os 4 primeiros minutos de reação. Este resultado sugere que o decaimento dos radicais seja devido a processos que ocorrem segundo vias distintas: uma mais rápida, que varia significativamente com o teor de bile, e uma mais lenta, cuja dependência com o teor de bile é menos pronunciada.
A Figura 1(B), em anexo, mostra um gráfico da porcentagem de ABTS●- versus 1/FD da bile bovina, onde FD é o fator de diluição. A diluição a ser feita para que uma amostra de bile bovina promova a redução de 50% dos radicais ABTS●- é de 0,6 ± 0,1.
A Figura 2(A), em anexo, apresenta o decaimento de radicais ABTS; frente à BR, mostrando que este pigmento também é capaz de reduzir o ABTS;, apresentando, como o esperado, atividade antioxidante. Os decaimentos indicam que a redução do ABTS; pela RB se dá segundo vias distintas, uma rápida e a outra mais lenta.
A Figura 2(B), em anexo mostra que concentração de radicais ABTS; reduzidos (calculada a partir da absorbância em 734 nm e do coeficiente de extinção molar neste comprimento de onda) aumenta linearmente com o aumento da concentração de BR. A inclinação da reta fornece a estequiometria da reação entre radicais ABTS; e BR, remetendo a um valor de 5 mols de ABTS; reduzidos por mol de BR. É possível sugerir, com base nesta estequiometria, que os sítios redutores da molécula de BR sejam um dos hidrogênios metilênicos e os hidrogênios dos pirróis
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos indicam que a bile bovina é capaz de reduzir radicais ABTS•-, apresentando atividade antioxidante. A diluição a ser feita para que uma amostra de bile bovina promova a redução de 50% dos radicais livres estáveis ABTS•- é de 0,6 ± 0,1. A bilirrubina contribui para a atividade antioxidante apresentada pela bile, uma vez que também é capaz de reduzir radicais ABTS•- em reações cuja estequiometria é de 5 mols de ABTS•- reduzidos por mol de BR. O valor de TEAC de 2,5, obtido para a bilirrubina apresenta valor comparável ao apresentado pelo flavonóide rutina, com TEAC de 2,4 (Benavente-Garcia, 2000).
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: • Benavente-Garcia, O.; Castillo, J.; Lorente, J.; Ortuño, A.; Del Rio, J. A. Food Chem. 2000, 68, 457.
• Devlin, T M.; Manual de bioquímica com correlações clínicas, 2003, Edgard Blucher Ltda.
• Maghzal, G. J.; Leck, M-C.; Collinson, E.; Stocker, R. J. Biol. Chem. 2009, 284, 29251.
• Mammana, C. Z. Cirurgia das vias bilares, 1981, Policor, Universo Literário.
• Mercuri, L. P., Estudo termoanalítico e caracterização química de cálculos biliares e bile humana, Tese de Doutorado, 2000, IQ-USP, São Paulo.
• Small, D. M.; Gallstones, N. Engl. J. Med. 1968, 270, 588.
