ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Purificação e caracterização de beta-glucosidase de Aspergillus sp. isolado do solo amazônico
AUTORES: BASTOS, R.P.S. (UFAM) ; SILVA-L.A.O. (UFAM) ; ALMEIDA-CAMPOS,F.R. (UFAM)
RESUMO: Dentre as vantagens existentes na utilização de enzimas, destacam-se a sua alta
especificidade, as condições suaves de reação e a redução de problemas ambientais e
toxicológicos. Sendo assim este trabalho teve como objetivo a purificação e
caracterização parcial da beta-glucosidase excretado pelo fungo Aspergillus sp.
utilizando sabugo de milho como fonte de carbono. Para tanto, o microrganismo mantido
em meio dextrose Agar batata foi inoculado através de suspensão de células. A
fermentação ocorreu em condição estacionária à temperatura ambiente por sete dias. A
purificação da enzima foi realizada em etapas que incluíram precipitação com sulfato
de amônia, cromatografia de troca iônica e filtração em gel.Em seguida,ocorreu a etapa
de caracterização.
PALAVRAS CHAVES: resíduo agrícola, sabugo de milho, beta-glucosidase
INTRODUÇÃO: Com o aquecimento Global houve um crescimento com as preocupações relacionadas às
questões ambientais o que tem incentivado a população mundial a buscar novas
tecnologias “limpas”, sofisticadas e baratas. Neste contexto, a tecnologia enzimática
tem ganhado espaço, isoladas ou juntamente com células íntegras, pois as enzimas são
usadas como biocatalizadores em processos industriais bem como na despoluição
ambiental(PHILIPPIDS & SMITH, 1995). O Brasil desponta na produção agrícola como
sendo um dos celeiros mundiais. Boa parte de nossa produção agrícola é exportada para
a Europa, países árabes e algumas partes do continente asiático. Porém uma produção
agrícola tão pujante traz alguns inconvenientes como a geração de resíduos
agroindustriais produzidos em usinas de açúcar,álcool e etc. Gacesa & Huble (1991),
apontam a produção de glicose a partir destes resíduos agrícolas como o melhor
destino a ser dado a estes poluentes.Portanto enzimas celulolíticas são
indispensáveis para a conversão de celulose em unidades de glicose que possam ser
fermentadas, produzindo o etanol. Assim, este trabalho teve como objetivo geral
purificar e caracterizar o principal componente beta-glucosidásico excretado pelo
fungo Aspergillus sp isolado da Amazônia e como objetivos específicos obter a enzima
beta-glucosidase purificada, determinar o pH e temperatura ótima do principal
componente excretado pelo fungo Aspergillus sp., avaliar a estabilidade térmica e
emdiferentes pHs da enzima purificada e determinar os parâmetros cinéticos Km e Vmáx
da enzima purificada.
MATERIAL E MÉTODOS: O fungo Aspergillus sp foi inoculado em meio sólido BDA e incubado por 7 dias à 28ºC
para formação de esporos. Após 7 dias de crescimento , preparou-se uma solução de
esporos a qual foi inoculada em 100 ml de meio líquido contendo: sabugo de milho
0,75g;e uma solução de micronutrientes. Para determinação da atividade beta-
glucosidásica foi utilizada a metodologia proposta por Kovács et al.,(2009),e a
determinação de proteína foi realizada pelo método colorimétrico de Bradford(1976).Ao
sobrenadante de cultura, em banho de gelo, foram adicionados, lentamente e sob
agitação contínua, sulfato de amônia de 0-40% e 40-70%(m/v) de saturação seguida de
centrifugação por 45 min a 4.000 g a 4ºC. O precipitado 2 foi ressuspendido em 2,0 mL
de tampão Tris-HCl, 20 mM e pH 7,4 e dialisado contra o referido tampão. 1,0 mL
desta solução foi submetido a cromatografia em coluna Resource Q (trocador aniônico)
com fluxo de 1,0 mL/min e a eluição das proteínas ligadas à resina foi realizada com
gradiente salino linear de 0-1M de NaCl.A atividade beta-glucosidásica foi medida nas
frações eluídas e aquelas contendo atividade enzimática foram observadas através de
eletroforese em gel de poliacrilamida(SDS-PAGE).As proteínas com o mesmo perfil foram
agrupadas e submetidas a uma cromatografia em Sephadex G-100 com um fluxo de 0,3
mL/min. A atividade beta-glucosidásica foi medida nas frações eluídas e aquelas
contendo atividade enzimática foram observadas através de SDS-PAGE. Após a conclusão
da etapa de purificação, a beta-glucosidase purificada foi submetida as etapas de
caracterização.Que consistiu nas análises do pH e temperatura ótimo, estabilidade em
diferentes pHs, estabilidade térmica, parâmetros cinéticos e efeitos de alguns íons
sobre a enzima purificada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A precipitação de proteínas com sulfato de amônia é conhecida por ser útil na
concentração de soluções diluídas de proteína e no fracionamento de mistura de
proteínas. O mecanismo de precipitação de proteínas com sais decorre de um aumento da
força iônica do sistema. A precipitação de proteínas com sulfato de amônia é uma
alternativa de baixo custo e amplamente empregada para purificação de um tipo de
proteína de interesse (BACILA, 2003). No presente trabalho utilizamos uma etapa
inicial de purificação através da adição de sulfato de amônia.Após a realização da
precipitação, o precipitado foi ressuspendido e submetido à cromatografia de troca
aniônica em uma coluna Resourse Q. Posteriormente as frações que apresentaram
atividade foram submetidas à eletroforese PAGE-SDS 12%, para analisar seu perfil
eletroforético. Detectou-se que embora as frações não estivessem puras(figura1),
apresentaram perfis idênticos muito menos complexos que o da amostra aplicada na
coluna. As frações foram reunidas e submetidas a uma cromatografia de filtração em
gel. A filtração em gel tem a finalidade de separar moléculas por tamanho e peso
molecular, as moléculas maiores são eluídas da coluna antes que as moléculas de pesos
moleculares menores.Após estas etapas de purificação e análise por SDS-PAGE, as
amostras foram reunidas e utilizadas para caracterização.A atividade enzimática
máxima observada foi no pH 4,5 e temperatura entre 60-70C. Possue uma melhor
estabilidade no pH 5 e uma estabilidade térmica em 30C.Todos os íons não afetaram a
atividade enzimática. A substância PMSF mostrou-se fraca inibidora para a enzima e, a
substância EDTA inibiu totalmente a atividade enzimática.Foi obtido um KM igual
6,2972 e um Vmáx de 0,2688. Todos os dados corroboram com os dados bibliográficos.
CONCLUSÕES: Pela caracterização da beta-glucosidase purificada com o substrato pNPG encontrou-se
como ótimo pH 4,5 entre 60ºC-70ºC. a enzima demonstrou-se pouco termoestável, quando
comparada a outras beta-glucosidases. A atividade da beta-glucosidase foi inibida pelo
íons MgCl2, CaCl2, KCl, NaCl e o reagente PSMF e o EDTA influenciou de uma forma
totalmente inibidora; enquanto o DTT apresentou uma influência positiva sobre a
enzima. A beta-glucosidase purificada demonstrou ser termoestável na temperatura de
30ºC e em pH nos valores de 4,5-8,0. Para o substrato pNPG foi obtido KM de 6,110 e
Vmax de 78,74.
AGRADECIMENTOS: Ao órgão de fomento FAPEAM
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BACILA, M. A Presença da galactoquinase em tecidos animais. Brazilian. Arch. Biology. Technology. P. 293-297.2003.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye biding. Analytical Biochemistry. V. 72, p. 248-254.
GACESA, P.; HUBBLE, J. The enzymatic treatment of waste materials. In: MARTIN, A.M(Ed.) Bioconversion of waste materials to industrial products. London: Elsevier Applied Science, 1991. cap.2, p. 39-61.
KOVÁCS K., SZAKACS, G., ZACCHI, G. Comparative enzymatic hydrolysis of pretreated spruce by supernatants, wole fermentation broths and washed mycelia of Trichoderma reesei and Trichoderma atroviride. Bioresource Technology 100 (2009), 1350-1357.
PHILLIPPDIS, P.G.;SMITH, K.T. Limiting factors in the simultaneous saccharification and fermentation process for conversion of cellulosic biomass to fuel ethanol. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 51/52, p. 117-123, 1995.
