ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE SENSORES IMPRESSOS NANOESTRUTURADOS PARA DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DA TROPONINA T CARDÍACA HUMANA

AUTORES: Silva, B.V.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Cavalcanti, I.T. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Silva, M.M.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Freitas, T.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Mattos, A.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Dutra, R.F. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO)

RESUMO: As troponinas cardíacas são proteínas estruturais do complexo contrátil do miocárdio, consideradas atualmente como moléculas padrão-ouro no diagnóstico do infarto. Neste trabalho, sensores impressos portáteis e descartáveis foram desenvolvidos para detecção eletroquímica da troponina T cardíaca humana através da interação antígeno-anticorpo. Nanotubos de carbono forma utilizados para modificação da matriz impressa, com o objetivo de explorar suas propriedades eletrocatalíticas e otimizar a sensibilidade e reprodutibilidade da plataforma sensora. A curva de calibração do imunossensor proposto apresentou uma boa linearidade (r = 0,992; p<0,0001; n=7) e limite de detecção (0,0035 ng/mL) dentro dos padrões clínicos de estratificação do dano cardíaco.

PALAVRAS CHAVES: eletrodos impressos; nanotubos de carbono; troponinas cardíacas

INTRODUÇÃO: Os marcadores cardíacos, em especial as troponinas cardíacas, são componentes essenciais utilizados para o diagnóstico do infarto, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Atualmente, diversos imunoensaios têm sido empregados na rotina laboratorial para dosagem das troponinas cardíacas (ALPERT et al., 2000; CHRISTENSON & AZZAZY, 2009). Entretanto estes apresentam significativas limitações para diagnóstico à beira do leito de pacientes infartados de modo prático, rápido e seguro. No intuito de desenvolver novas tecnologias para diagnóstico do infarto agudo do miocárdio, os imunossensores eletroquímicos na configuração de eletrodos impressos (EIs) surgem como importantes ferramentas analíticas, devido a sua alta sensibilidade, baixo custo, compatibilidade com as tecnologias de miniaturização de sensores e capacidade de produção em massa (METTERS, KADARA & BANKS, 2011). Considerando a imobilização como uma das etapas fundamentais no desenvolvimento de imunossensores, a introdução de nanomateriais que permitam aumentar a área eletroativa e a eficiência da imobilização, resultando numa maior sensibilidade destes dispositivos, tem sido realizada (HU & LI, 2011). Dentre os vários tipos de nanomateriais, os nanotubos de carbono (NTCs) têm recebido especial atenção devido as suas propriedades eletrocatalíticas, excelente condutividade elétrica e versatilidade para funcionalização com diferentes grupos proteína-reativo, que os tornam potencialmente úteis para aplicação em sensores eletroquímicos (YANG et al., 2010; SCIDA et al., 2011). Este trabalho tem como objetivo desenvolver um imunossensor eletroquímico empregando EI modificado com NTCs amino- funcionalizados (NTCs-NH2) para determinação da troponina T cardíaca humana (cTnT).

MATERIAL E MÉTODOS: O EI foi confeccionado através da impressão de um fino filme de tinta de carbono modificado com NTCs-NH2 sobre a superfície moldada do politereftalato de etila. Previamente a construção do protótipo sensor, os NTCs-NH2 foram dispersos no solvente orgânico dimetilformamida. Após o processo de confecção, o EI foi submetido a uma limpeza eletroquímico em KCl (0,1 M) durante 40 voltametrias cíclicas na faixa de potencial de -2 a 2 V, a velocidade de varredura de 100 mV/s (ALONSO-LOMILLO et al., 2011). Para imobilização da biomolécula a superfície sensora do EI, os grupamentos carboxílicos terminais dos anticorpos anti-cTnT foram ativados com uma solução de EDC (0,002 M) e NHS (0,005 M) preparada em tampão PBS (0,01 M; pH 7,4). Uma alíquota de 10 μL da solução de anti-cTnT ativado foi pipetada sobre a superfície do EI e mantida durante 60 min em câmera úmida à temperatura ambiente. Posteriormente, os sítios livres não específicos na interface sensora foram bloqueados com uma solução de glicina (0,05 M). Os ensaios eletroquímicos foram realizados usando um sistema tri- eletródico, que consistiu em um eletrodo de trabalho impresso (Ø= 4 mm), um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo de Ag/AgCl (KCl Sat.) como referência, acoplados a um potenciostato modelo PGSTAT 12 da marca AUTOLAB (Metrohm Pensalab, Brasil) e controlado pelo software GPES 4.9 (Eco Chemie BV, Holanda). Todas as medidas foram realizadas em K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em tampão PBS (0,01 M, pH 7,4). As técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial foram utilizadas, respectivamente, para caracterização da interface sensora e detecção eletroquímica da cTnT.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os grupos funcionais dos NTCs na interface da plataforma sensora foram estrategicamente empregados neste trabalho para imobilização dos anticorpos anti-cTnT. Os voltamogramas cíclicos na Figura 1 representam o perfil eletroquímico das etapas de construção do imunossensor. O EI como manufaturado exibiu uma separação de potencial de pico (ΔEp) de aproximadamente 0,68 V (curva I). Entretanto, após o condicionamento da superfície do sensor através do tratamento eletroquímico em KCl (0,1 M), observou-se um decréscimo do ΔEp para 0,38 V, indicando a remoção dos contaminantes orgânicos e impurezas na superfície (curva II). Quando o anti-cTnT foi imobilizado, o imunossensor apresentou uma diminuição da corrente farádica, resultado da redução da transferência de elétrons na interface da plataforma sensora (curva III). Após o bloqueio dos sítios ligantes não específicos com glicina, o mesmo comportamento anterior foi observado (curva IV). Análises por voltametria de pulso diferencial foram empregadas para detecção direta da cTnT e obtenção de uma curva de calibração do imunossensor. Para tais ensaios, o EI foi incubado com diferentes concentrações de cTnT e submetido a medidas voltamétricas em K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0.005 M) preparado em tampão PBS (0,005 M; pH 6,5). Os resultados obtidos na Figura 2 demonstram uma relação proporcional indireta entre os picos de corrente dos voltamogramas de pulso diferencial e as concentrações de cTnT. A curva de calibração do EI apresentou um coeficiente de correlação de 0,992 (p<0,001, n= 7), combinado a um baixo erro relativo (<<1%) e um baixo limite de detecção (0,0035 ng/mL). Esses resultados evidenciam a potencialidade do EI desenvolvido para uma futura aplicação como teste de pronto atendimento em emergências cardiológicas.

Figura 1.

Voltamogramas cíclicos das etapas de construção do imunossensor.

Figura 2

Curva de calibração do imunossensor.

CONCLUSÕES: A modificação do filme de carbono impresso com NTCs-NH2 contribuiu para o desenvolvimento de sensores mais simples e rápidos, dispensando o uso de polímeros e reagentes de ligação cruzada para funcionalização da interface sensora. Como perspectivas futuras deste trabalho, tem-se a realização de alguns estudos complementares, como testes com amostras de soro e sangue total.

AGRADECIMENTOS: Capes, UFPE e CETENE-PE.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ALONSO-LOMILLO, M.A.; DOMÍNGUEZ-RENEDO, O.; ROMÁN, L.D.T.D.; ARCOS-MARTÍNEZ, M.J. 2011. Horseradish peroxidase-screen printed biosensors for determination of Ochratoxin A. Analytical Chimica Acta, 688: 49-53.

ALPERT, J.S.; THYGESEN, K.; ANTMAN, E.; BASSAND, J.P. 2010. Myocardial infarction redefined-a consensus document of The Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee for the redefinition of myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology, 36: 959-969.

CHRISTENSON, R.H.; AZZAZY, H.M. 2009. Cardiac point of care testing: a focused review of current National Academy of Clinical Biochemistry guidelines and measurement platforms. Clinical Biochemistry, 42:150-157.

HU, W.; LI, C.M. 2011. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Nanomedicine and Nanobiotechnology, 3: 119–133.

METTERS, J.P.; KADARA, R.O.; BANKS, C.E. 2011. New directions in screen printed electroanalytical sensors: an overview of recent developments. Analyst, 136: 1067-76.

SCIDA, K.; STEGE, P.W.; HABY, G.; MESSINA, G.A.; GARCIA, C.D. 2011. Recent applications of carbon-based nanomaterials in analytical chemistry: critical review. Analytica Chimica Acta, 691: 6-17.

YANG, W.; RATINAC, K.R.; RINGER, S.P.; THORDARSON, P.; GOODING, J.J.; BRAET, F. 2010. Carbon Nanomaterials in Biosensors: Should You Use Nanotubes or Graphene? Angewandte Chemie International Edition, 49: 2114–2138.