52º CBQ - DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR BASEADO EM FIBRAS DE CARBONO PARA DETECÇÃO DA TOXINA RICINA EM TORTA DE MAMONA

ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR BASEADO EM FIBRAS DE CARBONO PARA DETECÇÃO DA TOXINA RICINA EM TORTA DE MAMONA

AUTORES: Freitas, T.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Mattos, A.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Silva, B.V.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Lima, R.M.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Dutra, R.F. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO)

RESUMO: A lectina ricina é a principal responsável pela toxicidade da torta de mamona. O desenvolvimento de biossensores para detecção da ricina apresenta vantagens quanto ao custo e tempo de execução. Biossensores são dispositivos eletrônicos que possuem um elemento biológico fixado numa superfície sensora acoplada a um transdutor. Dentre os materiais utilizados em biossensores estão as fibras de carbono (FC), devido às suas inúmeras vantagens, destacando-se: baixa densidade associada à alta resistência mecânica, boa condutividade e baixo custo. O objetivo do trabalho foi desenvolver um biossensor utilizando eletrodos de FC, para detecção da ricina na torta de mamona. O sistema proposto apresentou boa reprodutibilidade, estabilidade e linearidade com r=0,99875 (p<0,0001, n=5).

PALAVRAS CHAVES: ricina; biossensor; fibras de carbono

INTRODUÇÃO: O crescimento da produção de mamona no Brasil e a expectativa de plantio de grandes áreas com objetivo de produção de biocombustíveis atraiu atenção sobre a torta de mamona, um importante co-produto dessa cadeia produtiva (AZEVEDO & LIMA, 2001). A torta de mamona tem sido aproveitada como fertilizante, embora possa obter valor maior quando utilizada como alimento animal, devido ao seu alto teor protéico (BELTRÃO, 2005). No entanto, para ser usada como alimento, precisa passar por um processo de detoxificação, devido à presença de agentes tóxicos em sua composição (RIBEIRO & ÁVILA-FILHO, 2006). A lectina ricina é a principal responsável pela toxicidade da torta de mamona (SPIVAK & HENDRICKSON, 2005). Métodos para medição de ricina são essenciais para que se possa trabalhar com essa toxina tanto em pesquisa quanto em processamento industrial. Todos os processos analíticos de determinação desta lectina são sensíveis, porém envolvem metodologias complicadas e equipamentos caros, implicam em diversas etapas bioquímicas, requerem pessoal especializado, são testes demorados, além de serem de custo elevado considerando a relação custo versus benefício (FELTIS et al., 2008). O desenvolvimento de biossensores para detecção da ricina apresenta vantagens quanto ao custo e tempo de execução (RASOOLY & JACOBSON, 2006; VADDIRAJU et al., 2009). A utilização de FC como material eletródico surge como alternativa promissora no desenvolvimento de biossensores para a detecção de lectinas. A especificidade das lectinas com relação a carboidratos possibilita sua aplicação nas áreas biológicas e agronômicas (WU et al., 2006). O objetivo do trabalho foi desenvolver um biossensor com transdução eletroquímica, utilizando eletrodos de FC, para detecção da ricina na torta de mamona.

MATERIAL E MÉTODOS: Foi empregada uma célula eletroquímica convencional tri-eletródica (composta por um eletrodo de trabalho de FC; um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo de referência de Ag/AgCl) acoplada a um potenciostato modelo PGSTAT 12 da marca AUTOLAB (Metrohm Pensalab, Brasil), acoplado a um microcomputador e controlado pelo software GPES 4.9 (Eco Chemie BV, Holanda). As análises dos ensaios foram realizadas através da técnica de voltametria cíclica. As FC foram primeiramente modificadas por um filme polissacarídico de xiloglucana, pois possui em sua estrutura química resíduos de galactose, os quais são específicos e podem interagir com a (cadeia B) RTB da lectina ricina. Após incorporação da xiloglucana nas fibras, uma alíquota (35μL) da solução de ricina foi incubada na superfície do eletrodo. Efeitos quanto ao pH, natureza, concentração do eletrólito, tempo de interação lectina-carboidrato, reprodutibilidade e repetibilidade foram realizados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Ensaios para a otimização das condições experimentais foram realizados. A influência do pH na resposta voltamétrica do eletrodo proposto foi examinada na faixa entre 5,5 e 8,0. Observou-se um aumento da corrente de pico catódica com o aumento do pH até adquirir um valor máximo em pH 6,0. Então, o pH 6,0 foi adotado para os estudos posteriores. O desempenho do biossensor depende não só do pH, mas também da natureza do eletrólito suporte, bem como de sua concentração, podendo mudar sua estabilidade. Quatro tipos de soluções tampão foram avaliadas: PBS, HEPES, PIPES e TRIS. De acordo com a amplitude da corrente, o tampão PBS apresentou a melhor resposta eletroquímica. A concentração da solução eletrólica pode influenciar na resposta do eletrodo proposto. Desta forma, para a escolha da melhor concentração foram feitas medidas em tampão PBS, pH 6,0, nas molaridades 0,1; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 e 10 mMol L-1. A melhor resposta do eletrodo ocorreu até um plateau ser alcançado em 2,5 mMol L-1. O tempo de interação lectina-carbiodrato foi estudado e foi observado que o tempo de 25 minutos foi o suficiente para total interação da lectina ricina com os resíduos de galactose presentes na estrutura da xiloglucana. A reprodutibilidade do biossensor proposto foi investigada entre 10 eletrodos idênticos e apresentou boa reprodutibilidade com desvio padrão de 2,52%. Também se apresentou estável durante 25 ciclos de varredura contínuos, com baixo desvio padrão (0,3%) entre os ciclos. Após estabelecidas as condições experimentais, a reta de calibração da ricina foi adquirida, demonstrando boa linearidade com r=0,99875 (p<0,0001, n=5) (Figura 1). A curva de calibração da amostra real de torta de mamona foi levantada e o LD=1,201 µg/mL-1 e sensibilidade de 0,035 mA.μg/mL-1 (Figura 2).

Figura 1

Figura 2

CONCLUSÕES: Os resultados obtidos indicaram que o biossensor pode ser aplicado na determinação da ricina em amostras de torta de mamona, logo que a dose letal desta lectina para animais de grande porte está em torno de 1,0 mg/kg. O biossensor desenvolvido, baseado em fibras de carbono, foi inovador, prático e de baixo custo sem igual no mercado.

AGRADECIMENTOS: FACEPE, FINEP E UFPE.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. 2001. O Agronegócio da mamona no Brasil. Embrapa Informação Tecnológica, 2ª edição, Brasília – DF.
BELTRÃO, N. E. M. 2005. Torta de mamona (Ricinus communis L.): fertilizante e alimento. Comunicado técnico Embrapa, 171.
RIBEIRO, N. M.; AVILA-FILHO, F. D. F. 2006. Métodos para desintoxicação de tortas de oleaginosas. In: Anais do I Congresso da Rede Brasileira de Tecnologia de Biodiesel, Brasília – DF.
SPIVAK, L; HENDRICKSON, R. G. Ricin. Critical Care Clinics, 21: 815-824, 2005.
FELTIS, B. N.; SEXTON, B. A.; GLENN, F. L.; BEST, M. J.; WILKINS, M.; DAVIS, T. J. 2008. A Hand-held Surface Plasmon Resonance Biosensor for the Detection of Ricin and Other Biological Agents. Biosensors and Bioelectronics, 23: 1131-1136.
RASOOLY, A.; JACOBSON, J. 2006. Development of biosensors for cancer clinical testing. Biosensors and Bioelectronics, 21(10): 1851-1858.
VADDIRAJU, S.; TOMAZOS, I.; BURGESS, D. J.; JAIN, F. C.; PAPADIMITRAKOPOULOS, F. 2010. Emerging synergy between nanotechnology and implantable biosensors: a review. Biosensors and Bioelectronics, 25: 1553-1565.
WU, J. H.; SINGH, T.; HERP, A.; WU, A. M. 2006. Carbohydrate recognition factors of the lectin domains present in the Ricinus communis toxic protein (ricin). Biochimie, 88: 201–217.