ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: MODIFICAÇÃO DE MICROELETRODOS IMPRESSOS DE OURO COM FILME DE POLIPIRROL PARA DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSOR ELETROQUÍMICO PARA A DENGUE

AUTORES: Cavalcanti, I.T. (UFPE) ; Silva, B.V.M. (UFPE) ; Dias, A.C.M.S. (UFPE) ; Silva, M.M.S. (UFPE) ; Dutra, R.F. (UFPE)

RESUMO: Neste trabalho, microeletrodos impressos de ouro foram funcionalizados com filme de polipirrol para imobilização de anticorpos específicos contra proteínas do vírus dengue (DENV). A morfologia do microeletrodo foi analisada por microscopia de força atômica. As etapas de pré-tratamento e modificação da superfície foram caracterizadas pela espectroscopia de impedância eletroquímica. Diferenças significativas foram visualizadas após o recobrimento da superfície do eletrodo com o filme, ocasionando na formação de nódulos característicos, e no aumento da reatividade do eletrodo. As respostas eletroquímicas indicaram a imobilização estável dos anticorpos anti-DENV. Assim, torna-se promissor o desenvolvimento de um imunossensor eletroquímico para a dengue com boa sensibilidade e especificidade.

PALAVRAS CHAVES: Eletroquímico; imunossensor; dengue

INTRODUÇÃO: A dengue é a principal arbovirose tropical transmitida ao homem através da picada de mosquitos do gênero Aedes, e constitui um sério problema de saúde pública. O diagnóstico específico na fase aguda da doença ainda é considerado um desafio, tendo em vista algumas limitações dos métodos analíticos atualmente empregados. A funcionalização de microeletrodos impressos de ouro (“screen-printed”) com filme de polipirrol (Popy) pode se configurar como uma alternativa bastante atraente para o desenvolvimento de um imunossensor eletroquímico, visando a sua aplicação no diagnóstico rápido e econômico. Com o uso dos microeletrodos impressos, muitas limitações associadas aos eletrodos com dimensões convencionais podem ser minimizadas ou reduzidas, sobretudo na redução dos efeitos da capacitância e dos efeitos da resistência de solução, resultando num fluxo maior de espécies redox no eletrodo. Os polímeros condutores têm despertado um grande interesse científico e tecnológico nos últimos anos. Dentre os polímeros condutores mais estudados estão o Popy, cujo material é biocompatível e fácil de depositar, indicado para várias aplicações biológicas (ATEH et al., 2006). Além disso, apresenta enorme potencial para uso em dispositivos eletroquímicos devido a sua alta condutividade elétrica, reatividade redox, alta estabilidade térmica, e boa estabilidade química em condições ambientais normais. Neste trabalho, anticorpos anti-DENV foram imobilizados na superfície de microeletrodos impressos de ouro funcionalizados com filme de Popy com o intuito de desenvolver um imunossensor eletroquímico “label-free” para a dengue.

MATERIAL E MÉTODOS: Microeletrodos impressos de ouro (tipo AC1.W1.R1) e conectores específicos (tipo KA1.1) foram adquiridos da BVT Technologies (República Tcheca). Cada molde impresso apresenta uma configuração de três eletrodos (trabalho, auxiliar e referência). Técnicas eletroquímicas de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e voltametria por pulso diferencial foram registradas usando um potenciostato Ivium® (Ivium Technologies). Todos os experimentos foram realizados em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,0) 10 mM, contendo 5 mM do complexo redox ferricianeto e ferrocianeto de potássio (proporção de 1:1). A microscopia de força atômica (AFM) foi realizada para caracterização da morfologia da superfície do microeletrodo utilizando um microscópio WITec Alpha System 300. Preliminarmente, os microeletrodos impressos de ouro foram submetidos a pré-tratamento eletroquímico através da aplicação de vários ciclos voltamétricos com potencial entre 0 e +1,5 V, e scan rate de 50 mV/s em solução de ácido sulfúrico 0,5 M. Após o pré-tratamento, os eletrodos foram imersos em solução de cloreto de potássio 0,1 M contendo o mônomero de pirrol (0,1 M). A eletropolimerização por oxidação anódica foi obtida através da aplicação de 40 ciclos voltamétricos entre 0 e +0,8 V (vs. Ag/AgCl), com scan rate de 20 mV/s. Todas as medidas foram realizadas à temperatura ambiente (≈ 25°C). Após a funcionalização com o Popy, anticorpos específicos anti-DENV (AbCam, Reino Unido) na concentração de 1 μg/mL, preparados em PBS (0,01 M, pH 7,0), foram aplicados sobre o eletrodo e mantidos por 1 h à temperatura ambiente. Posteriormente a incubação, os eletrodos foram lavados com PBS (3 x) a fim de remover os anticorpos não ligados e foram submetidos a bloqueio dos sítios não-reativos com glicina 50 mM.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: As imagens do AFM na Fig. 1 mostram que a eletropolimerização do pirrol provocou alterações significativas na morfologia do microeletrodo. Foi notada a presença de regiões globulares, característica dos filmes de Popy (LISBOA et al., 2005). Além disso, pode ser observada uma regularidade na forma e no tamanho dos nódulos formados, sendo um indicativo de que o crescimento do filme de Popy (espessura entre 150 e 170 nm) ocorreu de forma instantânea (HWANG et al., 1997). Houve um aumento da área de superfície eletroativa do eletrodo modificado, resultando na diminuição da impedância elétrica. A análise por impedância (gráfico de Nyquist) após cada etapa da modificação do microeletrodo é mostrada na Fig. 2. Pode-se notar que a curva referente ao eletrodo pré-tratado exibe uma linha quase reta, característica de uma etapa difusional do processo eletroquímico. Depois da modificação da superfície do microeletrodo com o filme de Popy, a resistência de transferência de carga torna-se insignificante. Isto é devido ao fato do Popy catalisar eficientemente a reação redox do ferri/ferrocianeto na interface do eletrodo, com a consequente diminuição da resistência elétrica atribuída ao aumento efetivo da área de superfície. O acesso da sonda redox ao eletrodo foi dificultada após a incubação com os anticorpos, sugerindo que os anticorpos foram imobilizados no eletrodo e assim bloquearam a troca de elétrons entre a sonda redox e o eletrodo. Além disso, após o eletrodo ser submetido ao bloqueio com glicina, a resistência aumentou novamente. Desta forma, a modificação com o Popy mostra-se bastante funcional para construção do imunossensor, modificando a interface elétrica do microeletrodo e contribuindo na composição de uma camada biocompatível para a imobilização da proteína.

Fig. 1.

Imagens de AFM do microeletrodo mostrando (A) a superfície de ouro pré-tratada e a (B) superfície modificada com o filme de Popy.

Fig. 2.

Impedância após (A) modificação com filme de Popy; (B) após pré-tratamento; (C) após a aplicação do anti-DENV e (D) após bloqueio com glicina.

CONCLUSÕES: O filme eletropolimerizado de Popy revelou a formação de uma camada mais espessa, com a presença de regiões globulares, resultando na diminuição da impedância elétrica da superfície do microeletrodo, e consequentemente aumentando a sua condutividade. Dessa forma, foi mostrado neste trabalho a viabilidade da funcionalização de microeletrodos impressos de ouro com o uso do filme condutor de Popy como matriz de imobilização para anticorpos anti-DENV e a partir de então, na aplicação dos microeletrodos como imunossensor eletroquímico para a dengue.

AGRADECIMENTOS: A CAPES pelo auxílio financeiro.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ATEH, D.D.; NAVSARIA, H.A.; VADGAMA, P. 2006. Polypyrrole-based conducting polymers and interactions with biological tissues. Journal of the Royal Society Interface, 3: 741-752.
HWANG, B.J.; SHIEH, D.T.; CHIEH, W.C.; LIAW, D.-J.; LI, L.-J. 1997. Electropolymerization of pyrrole and 4-(3-Pyrrolyl) butane-sulfonate on Pt substrate: An in situ EQCM study. Thin Solid Films, 301: 175–182.
LISBOA, P.; GILLILAND, D.; CECCONE, G.; VALSESIA, A.; ROSSI, F. 2005. Surface functionalisation of polypyrrole films using UV light induced radical activation. Applied Surface Science, 252: 4397–4401.