ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: Prospecção de microrganismos produtores de biossurfactantes isolados de um solo contaminado com óleo vegetal
AUTORES: Dias, P.V.S. (UFPB) ; Carvalho, L.C.T. (UFPB) ; Padilha, I.Q.M. (UFPB) ; Gorlach-lira, K. (UFPB)
RESUMO: Neste trabalho foi analisada a produção de biossurfactantes por bactérias
isoladas de um solo contaminado com óleo vegetal residual. Das 66 linhagens
isoladas, todas demonstraram produzir biossurfactantes em pelo menos um dos três
métodos analisados. O teste de dispersão do óleo diesel permitiu a detecção de
biossurfactantes em todas as linhagens, enquanto a emulsificação e atividade
hemolítica foram observadas em 73% e 59% das linhagens, respectivamente. Os
resultados obtidos neste trabalho demonstraram que várias linhagens se
apresentaram como ótimas produtoras de biossurfactantes, o que favorece a
continuidade de pesquisas nessa área, com a finalidade caracterizar e isolar tais
moléculas, possibilitando sua utilização em diversos processos biotecnológicos.
PALAVRAS CHAVES: Solo; Bactérias; Biossurfactantes
INTRODUÇÃO: Devido à vasta diversidade, às grandes populações e à longa história evolutiva,
os microrganismos vêm contribuindo fortemente com a riqueza e complexidade das
interações entre os organismos do solo, incluindo desde simbioses altamente
específicas a mutualismos difusos (BEARE et al., 1995). Tais microrganismos são
componentes essenciais no processo de decomposição do solo, no qual resíduos de
plantas e animais são degradados em matéria orgânica, liberando nutrientes na
cadeia alimentar.
Como praticamente todos os surfactantes são quimicamente derivados de petróleo e
não apresentam biodegrabilidade, podendo ser tóxicos ao meio ambiente, o
interesse por surfactantes de origem biológica (biossurfactantes), tem aumentado
cada vez mais, uma vez que os mesmos são biodegradáveis. Com isso, há um
crescente interesse na possibilidade do uso de biossurfactantes no transporte de
petróleo em tubulações, no gerenciamento de derramamentos de óleo, na limpeza de
tanques de armazenagem de óleo, na biorremediação de solos e na recuperação
melhorada de petróleo (MEOR – microbial enhanced oil recovery) (DESAI; BANAT,
1999).
O interesse por biossurfactantes tem crescido cada vez mais nesses últimos anos,
principalmente devido as suas várias propriedades funcionais e por serem
produzidos por uma ampla faixa de microrganismos (MUTHUSAMY et al., 2008). Desta
forma, o objetivo do trabalho foi isolar linhagens bacterianas de um solo
contaminado com óleo vegetal residual, caracterizá-las morfofisiologicamente e
analisar a produção de biossurfactantes através de diferentes métodos.
MATERIAL E MÉTODOS: Área de estudo: a amostra de solo foi coletada em uma área experimental,
utilizada para descarte de óleo vegetal (João Pessoa-PB, 7°12'9,5" S -
34°48'21,8" O), em novembro de 2010.
Processamento do solo: diluições decimais seriais da amostra foram adicionadas a
meios de cultivo específicos. As placas foram incubadas a 30 °C e,
posteriormente, as bactérias foram isoladas.
Caracterização morfofisiológica das bactérias: as bactérias isoladas foram e
caracterizadas utilizando método de coloração de Gram, formação de endosporos e
teste de produção de catalase.
Produção de biossurfactantes: Para analisar a produção de biossurfactantes, as
linhagens foram cultivadas no meio caldo nutriente com adição de azeite (1%) por
7 dias (30ºC, 150 rpm). a) Teste de emulsificação: 2 mL da cultura e do
sobrenadante foram transferidos para tubos de ensaio adicionando 2 ml de óleo
diesel. Os tubos foram agitados em vórtex e deixados em repouso durante 5
minutos (E5 – índice de emulsificação após 5 minutos) e 24 horas (E24 – índice
de emulsificação após 24 horas). b) Teste de dispersão: em uma placa de Petri
contendo 35 mL de água e 100µL de óleo diesel, 10µL tanto da cultura bacteriana
quanto do sobrenadante foram adicionados à superfície de óleo e a formação de
uma zona clara indicou o tamanho da zona de dispersão. c) Atividade hemolítica e
produção de ramnolipídeos: as linhagens foram incubadas no meio ágar sangue
(contendo sangue de coelho desfibrinado – 5%) e a formação um halo claro ao
redor da colônia bacteriana indicou a produção de biossurfactantes. As linhagens
positivas foram submetidas à análise da produção de ramnolipídeos, que foi
detectada através da formação de um halo azulado ao redor da colônia, após a
incubação das linhagens em estufa a 30 °C por 21 dias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Neste trabalho, 66 linhagens bacterianas foram isoladas. Com base nas
características morfofisiológicas, as linhagens foram agrupadas em sete biótipos
(Figura 1). Em relação ao poder de emulsificação, 73% das linhagens
emulsificaram o óleo diesel com os índices de emulsificação (E24) entre 10,5% e
60,5% (Figura 2). O sobrenadante livre de células revelou que 68,1% das
linhagens produziram surfactantes extracelulares, apresentando índices de
emulsificação E24 entre 5,2% e 60,5%. Quanto ao poder de dispersão, 50% das
culturas bacterianas apresentaram uma zona de dispersão de 140 mm, enquanto que
apenas 25% do sobrenadante livre de células apresentaram uma zona de dispersão
de 140 mm. No meio ágar sangue, após 96 horas, 57,5% das linhagens apresentaram
a formação de um halo hemolítico ao redor da colônia. Destas, apenas duas
demonstraram produzir ramnolipídeos. O método de dispersão do óleo diesel
demonstrou ser o mais eficiente para detecção de biossurfactantes. De acordo com
Morikawa (2000), a análise de dispersão do óleo é um sistema de ensaio sensível
e conveniente para se analisar a presença de biossurfactantes, uma vez é capaz
de detectar os mesmos até quando sua atividade e sua quantidade não é tão alta.
Segundo Willumsen e Karlson (1997), um critério utilizado para analisar a
capacidade de estabilização da emulsão está relacionado diretamente à capacidade
da cultura bacteriana ou do sobrenadante em manter pelo menos 50% do volume
original 24 horas após a formação da emulsão. A análise da formação do halo
hemolítico no meio ágar sangue tem sido utilizada para selecionar microrganismos
produtores de surfactina e ramnolipídeos, sendo o tamanho do halo de hemólise
associado à capacidade de produção dessas substâncias (BANAT, 1993; CARRILLO et
al., 1996).
Tabela 1 - Biotipos das linhagens bacterianas isoladas do solo contami
Figura 1 - Emulsificação do óleo diesel por cultura bacteriana.
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que várias linhagens se
apresentaram como ótimas produtoras de biossurfactantes, o que favorece a
continuidade de pesquisas nessa área, com a finalidade caracterizar e isolar tais
moléculas, possibilitando sua utilização em diversos processos biotecnológicos.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem o suporte financeiro do CNPq e CAPES.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BANAT, I.M. The isolation of a thermophilic biosurfactant-producing Bacillus species. Biotechnology Letters, v.15, n.6, p.591– 594, 1993.
BEARE, M.H.; COLEMAN, D.C.; CROSSLEY, D.A; HENDRIX, P.F.; ODUM, E.P. A hierarchical approach to evaluating the significance of soil biodiversity to biogeochemical cycling. Plant Soil, v. 170, p. 5-22, 1995.
CARRILLO, P.G., MARDARAZ, C., PITTA-ALVAREZ, S.J., GIULIETTI, A.M. Isolation and selection of biosurfactant-producing bacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v.12, p.82– 84, 1996.
DESAI, J.D.; BANAT, I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.61, p.47–64, 1999.
MORIKAWA, M.; HIRATA, Y.; IMANAKA, T. A study on the structure– function relationship of the lipopeptide biosurfactants. Biochimica et Biophysica Acta, v.1488, p.211 – 218, 2000.
MUTHUSAMY, K.; GOPALAKRISHNAN, S.; RAVI, T.K.; SIVACHIDAMBARAM, P. Biosurfactants: Properties, commercial production and application. Current Science, v.94, n.6, 2008.
WILLUMSEN, P.A.; KARLSON, U. Screening of bacteria, isolated from PAH-contaminated soils, for production of biosurfactants and bioemulsifiers. Biodegradation, v. 7, n.5, p.415-423, 1997.
