52º CBQ - Biossensor eletroquímico baseado no uso da tecnologia do eletrodo impresso para detecção de peróxido de hidrogênio em leite.

ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: Biossensor eletroquímico baseado no uso da tecnologia do eletrodo impresso para detecção de peróxido de hidrogênio em leite.

AUTORES: Souza, C.M. (UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO) ; Dias, A.C.M.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Silva, M.M.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Cavalcanti, I.T. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Dutra, R.F. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO)

RESUMO: Um biossensor eletroquímico foi desenvolvido para determinação de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) em amostras de leite. Eletrodos impressos (EI), à base de tinta de carbono e nanotubos de carbono, foram confeccionados no suporte de PET, curados a 80°C por 1h. A superfície do EI foi funcionalizada com filme de polietilenoimina para imobilização da enzima peroxidase. Um aumento do pico catódico de corrente foi observado em função da concentração de H₂O₂, caracterizando um comportamento catalítico típico da enzima. A curva de calibração do biossensor revelou alta linearidade, com r=0,99391. O biossensor desenvolvido apresenta boa sensibilidade e especificidade, com um grande potencial para detecção de H₂O₂ em amostras de leite.

PALAVRAS CHAVES: biossensor; eletrodo impresso; peróxido de hidrogênio

INTRODUÇÃO: O leite é um alimento altamente perecível, alvo de intensas fraudes que visam ao aumento da vida útil da matéria-prima e consequente melhora no repasse do produto para a comercialização. A adição de H₂O₂ ao leite está atribuída à sua ação de bactericida (ALPAT et al., 2009). Contudo, a propriedade oxidante do composto pode representar, em longo prazo, um problema sério para a saúde. Uma vez que a adição de H₂O₂ ao leite compromete a sua qualidade, torna-se imprescindível o controle deste importante alimento distribuído aos consumidores. Atualmente, o método de determinação de H₂O₂ recomendado pela ANVISA envolve titulação com permanganato de potássio e possui limite de detecção de 300 ppm (SILVA et al., 2011). O desenvolvimento de um biossensor baseado na tecnologia do eletrodo impresso (EI) possibilita um controle de qualidade do leite de forma rápida e eficiente através da detecção da presença de H₂O₂ no produto. A tecnologia do EI em biossensores eletroquímicos tem sido empregada com sucesso. Esta técnica possibilita a produção em larga escala de eletrodos descartáveis a um baixo custo e com elevada reprodutibilidade (FERNÁNDEZ-BALDO et al., 2009). O material compósito impresso pode ser alterado ela adição de diferentes substâncias, tais como metais, enzimas, polímeros, agentes complexantes, dentre outros. Assim, a seletividade e a sensibilidade requeridas para cada análise são determinadas pela composição da pasta utilizada para impressão dos eletrodos (RENEDO et al., 2007). Neste trabalho, foi desenvolvido um biossensor eletroquímico baseado na tecnologia de EIs para detecção de peróxido de hidrogênio em amostras de leite.

MATERIAL E MÉTODOS: Uma mistura de tinta de carbono e nanotubos de carbono de parede múltipla funcionalizados com carboxilas (NTC-COOH) foi distribuída de forma homogênea na superfície plana do politereftalato de etileno (PET), com dimensões 2 x 1 cm. Os EIs foram curados à temperatura de 80ºC por 1 h. Após pré-tratamento da superfície do EI, um filme de polietilenoimina (PEI) foi obtido através da imersão do eletrodo em solução aquosa de PEI, por 1 h, à temperatura ambiente. Foram estudadas diferentes concentrações do PEI. Após isso, uma solução de 10 μL de peroxidase (HRP) 1 μg/mL, diluída em tampão fosfato de sódio (PBS) 100 mM, pH 7,4, foi pipetada sobre a superfície nanoestruturada do EI e incubada por 1 h, à temperatura ambiente. Foram obtidos voltamogramas cíclicos do EI utilizando diferentes concentrações de H₂O₂ (1; 2,5; 5; 7,5; 10; 15; 20; 25 e 30 mM), diluído em PBS 100 mM, pH 7,4, sob velocidade de varredura de 0,1 V/s e variação do potencial de -0,8 a +0,8 V. O biossensor foi testado em amostras de leite sem e com adição de H₂O₂ 10 mM. A técnica de voltametria cíclica foi empregada para caracterização eletroquímica dos EIs. Foram registrados voltamogramas cíclicos do EI em solução de PBS 100 mM, no intervalo de potencial de -0,8 a +0,8 V, e em soluções de Ferri/Ferrocianeto de potássio 5 mM, variando-se o potencial entre -0,6 e 1,0 V, sob velocidade de varredura de 0,1 V/s. As medidas de voltametria cíclica foram aplicadas no potenciostato acoplado aos três eletrodos, realizadas à temperatura ambiente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Neste trabalho, utilizou-se o PEI para imobilização da peroxidase na plataforma sensora. No estudo de concentração do PEI (0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 e 10%), observou- se um aumento da área dos picos proporcional à concentração do polímero, alcançando-se um platô na concentração 2,5%. Quando o EI foi recoberto com PEI 2,5%, os voltamogramas cíclicos na presença do Ferri/Ferro revelaram um aumento das correntes dos picos anódico e catódico de 33,07% e 49,33%, respectivamente, em relação ao EI limpo. O efeito da concentração de peroxidase na resposta do biossensor também foi estudado, no qual se observou um aumento da corrente proporcional à quantidade de peroxidase imobilizada, alcançando um platô na concentração de 2 mg/mL. A performance catalítica do biossensor proposto foi investigada através da variação da corrente dos picos catódicos quando os eletrodos foram submetidos a diferentes concentrações de H₂O₂ (1; 2,5; 5; 7,5; 10; 15; 20; 25 e 30 mM). Os resultados mostraram um aumento linear proporcional à concentração de H₂O₂ (Fig. 1). A curva de calibração do biossensor apresentou alta linearidade, com r=0.99391 (n=6). O biossensor foi testado em amostras de leite sem e com adição de H₂O₂ 10 mM. Foi possível detectar um aumento na corrente do pico catódico de 58,81%, no potencial de -0.5 V (Fig. 2). Sendo assim, o biossensor desenvolvido pode ser empregado para determinação de H₂O₂ em amostras de leite sem necessidade de diluição, constituindo um método prático e de baixo custo, comparado aos métodos usuais.

Fig. 1:

Resposta do biossensor a diferentes concentrações de H2O2. Inset: Curva de calibração do biossensor para H2O2 (1; 2.5; 5; 7.5; 10; 15 e 20mM).

Fig. 2:

Voltamogramas cíclicos do EI em amostras de leite sem e com adição de H2O2 10 mM.

CONCLUSÕES: A plataforma sensora utilizando EIs descartáveis funcionalizados com PEI representa um método simples e eficaz para análises de amostras de leite adulteradas com peróxido de hidrogênio.

AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem ao CNPq e FACEPE pelo suporte financeiro.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ALPAT, S.; ALPAT, S. K.; DURSUN, Z.; TELEFONCU, A. 2009. Development of a new biosensor for mediatorless voltammetric determination of hydrogen peroxide and its application in milk samples. Journal of Applied Electrochemistry, 39: 971-977.
FERNÁNDEZ-BALDO, M. A.; MESSINA, G. A.; SANZ, M. I.; RABA, J. 2009. Screen-printed immunosensor modified with carbon nanotubes in a continuous-flow system for the Botrytis cinerea determination in apple tissues. Talanta, 79: 681–686.
RENEDO, O. D.; ALONSO-LOMILLO, M. A.; MARTÍNEZ, M. J. A. 2007. Recent developments in the field of screen-printed electrodes and their related applications. Talanta, 73: 202-219.
SILVA, V.P.A.; ALVES, C.R.; DUTRA, R.F.; OLIVEIRA, J.E.; RONDINA, D.; FURTADO, R.F. 2011. Biossensor amperométrico para determinação de peróxido de hidrogênio em leite. Eclética Química, 36(2): 143-157.