ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: MAXIMIZAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE QUERATINASE DE BACILLUS SP. P45 UTILIZANDO ULTRAFILTRAÇÃO
AUTORES: Ribeiro Machado, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Escher Severo, E. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Gonçalves de Oliveira, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Ores, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Juliano Kalil, S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Brandelli, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL)
RESUMO: O objetivo do trabalho foi maximizar o processo de concentração e purificação da
enzima queratinase de Bacillus sp. P45 por ultrafiltração. A enzima produzida
por cultivo submerso utilizando farinha de pena no meio de cultura foi
concentrada e purificada por ultrafiltração. Foi avaliada a influencia da massa
molar de corte (10 e 30 kDa), do pH (7 e 8) e pressão de operação (1,5 e 2,5
kgf/cm2) na recuperação enzimática ,fator de purificação e fator de concentração
de atividade no processo através de um planejamento experimental 2³. A
maximização do processo foi obtida utilizando membrana de 10 kDa, pressão de
operação de 1,5 kgf/cm² e pH 8, alcançando fator de purificação na ordem de 4
vezes, recuperação enzimática entre 82 e 88% e fator de concentração de
atividade de 3,7 vezes.
PALAVRAS CHAVES: farinha de pena; queratinase; ultrafiltração
INTRODUÇÃO:
A indústria avícola produz uma grande quantidade de penas que se
acumulam em forma de lixo após o processamento das aves para consumo humano
podendo causar um grande impacto ambiental (ONIFADE et al., 1998). A queratina
representa cerca de 90% do peso das penas de aves domésticas. Esta proteína é
degradada por enzimas específicas, denominadas queratinases, que são capazes de
hidrolisar as ligações peptídicas da queratina e são produzidas por diversos
micro-organismos.Essas enzimas podem ser usadas na bioconversão das penas em
aminoácidos, alguns essenciais, que podem ser adcionados em rações animais (SAID
e PIETRO, 2004; SALES et al., 2008). Estudos recentes concentram-se nas
bactérias queratinolíticas destacando os gêneros Bacillus e Streptomyces
(BRANDELLI, 2008). Queratinases de Bacillus sp., em particular, B. licheniformis
e B. subtilis, tem sido amplamente estudadas devido à sua eficácia em termos de
degradação de penas e por serem estáveis em ampla faixa de pH e temperatura
(PRAKASH et al., 2009). A utilização das queratinases é restrita ao seu grau de
pureza sendo necessárias estratégias para sua separação a fim de obter a enzima
de interesse separada de contaminantes presentes no extrato enzimático. O
processo de ultrafiltração é um processo de separação por membranas (SPM), que
tem sido considerado como uma alternativa aos processos de separação existentes
para recuperar, concentrar e purificar macromoléculas. Além disso, os processos
de separação por membranas vêm sendo cada vez mais difundidos em função da
constante redução do custo de equipamentos e membranas. Assim, o objetivo deste
trabalho foi a maximização da concentração e purificação de queratinase de
Bacillus sp. P45 utilizando a ultrafiltração.
MATERIAL E MÉTODOS: O micro-organismo Bacillus sp P45 foi gentilmente cedido pelo Laborátorio de
Bioquímica e Microbiologia Aplicada do Departamento de Ciência de Alimentos
(ICTA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Foi mantido a 4°C em ágar
BHI (SIRTORI et al., 2006; DAROIT, CORRÊA e BRANDELLI, 2009) e o inóculo foi
preparado incubando-se a bactéria em ágar BHI a 30 °C por 24h. A enzima foi
produzida por cultivo submerso conforme Daroit, Corrêa e Brandelli (2011)
utilizando o meio de cultura composto por (g/L): farinha de pena (50) e NH4Cl
(5,25) preparado em meio mineral (NaCl (0,5); K2HPO4 (0,3) e KH2PO4 (0,4)). O pH
do meio foi ajustado 7,0 e o cultivo foi iniciado com 1% (v/v) de inóculo. As
condições de cultivo foram 30 ºC, 125 rpm por 48 h. Ao término do cultivo o
sobrenadante foi separado por centrifugação (5.000 x g por 20 min), obtendo o
extrato enzimático bruto.
Para os ensaios de ultrafiltração foi realizado um planejamento experimental 23
para avaliar a influencia da massa molar de corte (MMC) (10 e 30 kDa, MILIPORE)
,do pH (7 e 8) e pressão de operação de (1,5 e 2,5 kgf/cm2 ) na recuperação
enzimática,no fator de purificação e fator de concentração de
atividade,totalizando 8 ensaios realizados em duplicata.A matriz do planejamento
com os valores codificados e reais está apresentada na Tabela 1.Os ensaios foram
feitos em uma unidade de bancada do tipo dead-end com volume útil de 200 mL sob
agitação constante a 15 ºC. A atividade queratinolítica (Daroit et al 2009) e o
teor de proteína total (Lowry;1951) no extrato inicial, no retido e no permeado
foram quantificados após cada ensaio. A análise dos dados foi realizada
utilizando o programa Statistica 7.0, com um nível de confiança de 95%.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A Tabela 1 apresenta os valores obtidos para as respostas avaliadas no
planejamento experimental. O fator de purificação variou de 1,9 a 4,1 vezes, a
recuperação de 41,3 a 87,8%, e o fator de concentração de atividade de 1,7 a 3,7
vezes, sendo que os melhores valores foram obtidos no ensaio 3.
Foram obtidos modelos para o processo de recuperação, purificação e concentração
da queratinase em função das variáveis significativas codificadas. Para a
verificação da validade dos modelos foi realizada uma análise de variância
(ANOVA), onde se observou a validade dos mesmos através do teste de Fisher,
sendo o valor de F 3 vezes maior que o tabelado para o fator de purificação, 90
vezes maior para a recuperação, e 76 vezes maior para o fator de concentração de
atividade. Os valores de coeficiente de correlação obtidos foram 0,84, 0,99 e
0,99 para o fator de purificação, recuperação e fator de concentração de
atividade, respectivamente. Desta forma, os modelos obtidos são considerados
preditivos e significativos.
A partir dos modelos foi possível construir as superfícies de resposta e as
curvas de contorno para analisar as melhores condições de pH, pressão e MMC que
levam a uma maior concentração da enzima, bem como maiores valores de fator de
purificação e recuperação da queratinase. A Figura 1 apresenta a superfície de
resposta e curva de contorno obtidas para o fator de purificação.
Através das análises das superfícies a maximização da concentração,
purificação e foi obtida utilizando a membrana com massa molar de corte de 10
kDa, pressão de operação de 1,5 kgf/cm² e pH 8, alcançando fator de purificação
na ordem de 4 vezes, recuperação entre 82 e 88% e fator de concentração de
atividade na ordem de 3,7 vezes.
Tabela 1
Matriz do planejamento experimental 2³, valores
codificados e reais (entre parênteses), e médias de
cada resposta avaliada.
Figura 1
(a) Superfície de resposta e (b) curva de contorno
para o fator de purificação
CONCLUSÕES: A ultrafiltração demonstrou ser uma técnica potencial tanto para a concentração
como para a purificação da enzima queratinase obtida de Bacillus sp. P45, pois
proporcionou em altos fatores de purificação (4 vezes), recuperação (88%) e fator
de concentração de atividade (3,7 vezes).
AGRADECIMENTOS: CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BRANDELLI, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food and Bioprocess Technology. v. 1, n. 2, p. 105-116, 2008.
DAROIT, D. J.; CORRÊA, A. P. F.; BRANDELLI, A. Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp. P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus. International Biodeterioration and Biodegradation, v. 63, n. 3, p. 358-363, 2009.
DAROIT, D. J. ; CORRÊA, A. P. F.; BRANDELLI, A. Production of keratinolytic proteases through bioconversion of feather meal by the Amazonian bacterium Bacillus sp. P45. International Biodeterioration and Biodegradation, v.65, p. 45-51, 2011.
LOWRY, O.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, v. 193, p. 265-275, 1951.
ONIFADE, A.; AL-SANE, N.; AL- MUSALAM. A.; AL-ZARBAN, S. A review: potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Bioresour Technol. v. 66, p. 1–11, 1998.
PRAKASH, P.; SENIGALA K.; JAYALAKSHMI; SREERAMULU, K. Production of Keratinase by Free and Immobilized Cells of Bacillus halodurans Strain PPKS-2: Partial Characterization and Its Application in Feather Degradation and Dehairing of the Goat Skin. Appl Biochem Biotechnol, 2009.
SAID, S.; PIETRO, R. C. L. R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto: Legis Summa. p. 413, 2004.
SALES, M. R.; CAVALCANTI, M. T. H.; FILHO, J. L. L.; MOTTA, C. M. S.; PORTO, A. L. F. Utilização de penas de galinha para produção de queratinase pó Aspergillus carbonarius. Pesq. agropec. bras., Brasília. v. 43, n. 2, p. 285-288, 2008.
