ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: Determinação do perfil peptídico de hidrolisados da caseína do leite caprino por espectrometria de massa MALDI-TOF

AUTORES: Bezerra, V.S. (UFPE) ; Porto, A.L.F. (UFRPE) ; Campos, J.F. (CETENE) ; Campos, J.F. (CETENE)

RESUMO: Este trabalho visa a determinação dos perfis peptídicos de hidrolisados protéicos da caseína hidrolisada com papaína, tripsina e uma protease extraída de Penicillium aurantiogriseum URM 4622, enfatizando sua utilização na produção de peptídeos bioativos. Hidrolisados da caseína com graus de hidrólise de 28,3; 28,9 e 28,6% obtidos em tempo de reação de 5h e 40oC com o uso da papaína e tripsina e 3h e 40oC com a protease extraída de P. aurantiogriseum, as quais foram avaliados os perfis peptídicos por espectrometria de massa MALDI-TOF (Bruker Daltonics INC). Os peptídeos do permeado (<3000 Da) apresentaram peptídeos já descritos na literatura por apresentar propriedades biológicas ou funcionais, possibilitando o seu uso como suplementos nutricionais ou aditivos alimentícios.

PALAVRAS CHAVES: perfil peptídico; MALDI-TOF; proteases

INTRODUÇÃO: As atividades biológicas e fisiológicas das proteínas do leite podem ser atribuídas a vários peptídeos, principalmente aqueles de baixo peso molecular que podem ser produzido in vitro por hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática de proteínas tem sido usada para produzir ingredientes com melhores propriedades nutricionais e funcionais (Gomez-Ruiz et al, 2008). Hidrolisados protéicos podem ser classificados em três grandes grupos, dependendo do grau de hidrólise, que determina as suas aplicações: (a) hidrolisados com um baixo grau de hidrólise com melhores propriedades funcionais, (B) hidrolisados com um grau variável de hidrólise, que são usado principalmente como aromatizantes, e (c) hidrolisados extensos que são principalmente usados como suplementos nutricionais e de dietas especiais médicos (Pedroche et al., 2004). A determinação do perfil peptídico de hidrolisados de proteínas do leite é importante na predição de propriedades bioativas. Vários artigos foram publicados (Birkemo et al., 2009; Gomez-Ruiz et al, 2008 e Zhang et al, 2009) os quais demonstraram os perfis peptídicos de hidrolisados proteícos de caseína obtidas de leite de várias espécies: bovina, ovina, bubalina e caprina. Entretanto, nenhum relato foi observado com hidrolisados da caseína obtida de leite de cabra da raça moxotó. Caprinos apresentam grande variabilidade genética e por isso geram diferentes peptídeos durante a proteólise enzimática, representando um atrativo na produção de bioativos. Este trabalho visa a determinação do perfil peptídico de hidrolisados proteicos da caseína hidrolisada com papaína, tripsina e proteases extraída de Penicillium aurantiogriseum URM 4622, enfatizando sua utilização na produção de peptídeos bioativos.

MATERIAL E MÉTODOS: O leite caprino da raça Moxotó foi obtido de um animal puro. O leite foi proveniente do Município de Sertânia, Pernambuco, Brasil. As amostras de leite foram congeladas imediatamente após a coleta. A extração da caseína foi realizado segundo Egito et al. (2006), com modificações. O precipitado da caseína foi solubilizado com 1 mol L‑1 de NaOH, até pH 7,0, e submetido à diálise contra água deionizada a 4ºC por 96 horas e em seguida liofilizado. Após a liofilização, foram preparadas soluções que continham 2% de caseína em solução tampão fosfato 0,1 mol L‑1. Após a hidrólise, as amostras foram submetidas à agitação por 30 segundos e levadas a banho‑maria (90ºC, por 15 minutos) para inativação das enzimas. O grau de hidrólise (GH) da caseína usando as enzimas proteolíticas foi de acordo com Centenaro et al., 2009, as quais foram centrifugadas a 12.000 g, durante 10 minutos, o sobrenadante usado para a determinação de proteínas solúveis. O GH foi expresso segundo a relação das quantidades de proteínas solúveis determinadas pelo método de Lowry et al. (1951), albumina de soro bovino (BSA) foi usado como padrão; as proteínas totais presentes no substrato foram determinadas pelo método de Kjeldahl. Estas foram submetidos a membrana de ultrafiltração com cut off de 3000Da para obtenção das frações permeado(<3000Da) e retentado (>3000Da). Hidrolisados da caseína com graus de hidrólise de 28,3; 28,9 e 28,6% obtidos em tempo de reação de 5h e 40oC com o uso da papaína e tripsina e 3h e 40oC com a protease extraída de P. aurantiogriseum foram utilizadas para avaliação do perfil peptídico usando espectrômetro de massa MALDI-TOF (Bruker Daltonics INC).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os perfis peptídicos (tabela 1)dos hidrolisados protéicos da caseína caprina da raça moxotó usando proteases de origem animal, vegetal e microbiana foram comparado a literatura, a fim de predizer as propriedades biológicas. Os peptídeos permeado (<3000 Da) da caseína hidrolisados com a papaína no detectaram-se 34 peptídeos, dos quais 12 foram descritos por apresentar propriedades biológicas ou funcionais, destacando-se a propriedade antioxidante (Zhang et al, 2009 e Sabeena Farvin et al (2010). Os peptídeos permeado (<3000 Da) da caseína hidrolisados com tripsina detectaram-se 50 peptídeos, dos quais 17 configuram na literatura por apresentar propriedades antioxidantes , antimicrobianas, imunomoduladoras e carreadoras de minerais (Srinivas & Prakash, 2010, Gomez-Ruiz et al, 2008 e Sabeena Farvin et al., 2010). A fração peptídica com Massa molecular de 2164Da, refere-se a f(4-22) da αS1 caseína (Hill, Lahav, Givol, 1974), o qual também foi identificado neste trabalho, quando hidrolisou-se a caseína caprina com a protease microbiana. Os peptídeos permeado (<3000 Da) da caseína hidrolisados com a protease vegetal papaína detectaram-se 53 peptídeos, dos quais 17 já descritos por apresentar propriedades biológicas (Birkemo et al., 2009). O peptídeo de massa molecular 2107Da presumidamente refere-se a seqüência de aminoácidos da β-caseína f(191- 207). Esse peptídeo apresenta alto teor de tirosina e triptófano, constituindo- se uma característica importante de peptídeos com antioxidante.





CONCLUSÕES: Os perfis peptídicos da caseína caprina aqui investigados, demonstraram a presença de peptídeos presumidamente detentores de propriedades antioxidantes, imunomoduladores, antimicrobianos e carreadoras de minerais, possibilitando o uso dos hidrolisados enzimáticos como alimentos funcionais ou aditivos na indústria de alimentos.

AGRADECIMENTOS: A CAPES, CNPq, FACEPE, Faculdade São Miguel-Recife pelo apoio financeiro e ao CETENE pela realização da análise de MALDI TOF.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BIRKEMO, G. A. et al. Antimicrobial activity of two peptides casecidin 15 • and 17, found naturally in bovine colostrum. Journal of Applied Microbiology, v. 106, n. 1, p. 233-240, 2009.

CENTENARO, G. S.; PRENTICE-HERNÁNDEZ, C.; SALAS-MELLADO, M. Efeito da concentração de enzima e de substrato no grau de hidrólise e nas propriedades funcionais de hidrolisados protéicos de corvina (Micropogonias furnieri). Química Nova, v. 32, n. 7, p. 1792-1798, 2009.

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