ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: Isolamento e Seleção de fungos amilolíticos de resíduo líquido da indústria de farinha (manipueira).

AUTORES: Silva, A.C.A.D. (CRQ XIV / INPA) ; Souza, J.V.B. (INPA / MCT)

RESUMO: Amilases são utilizadas para fazer a sacarificação do amido em várias atividades industriais como: panificação, produção de combustíveis, produção de xarope de açúcar, têxtil e papel.O objetivo deste trabalho foi investigar o isolamento e seleção de fungos amilolíticos de resíduo líquido da indústria de farinha (manipueira).O isolamento dos fungos foi realizado a partir do resíduo liquido da manipueira. Foi realizado um ensaio de crescimento radial com os isolados obtidos onde foi observando o crescimento dos isolados em meio sólido que tinha como principal fonte de carbono amido. O isolamento resultou no em 20 isolados fúngicos sendo 2 identificados como Aspergillus sp e 1 identificado como Penicillium sp.

PALAVRAS CHAVES: FUNGOS; AMILASES; AMIDO

INTRODUÇÃO: Há muito tempo, o homem utiliza enzimas para catalisar uma série de reações. A produção de vinho, pão e queijo antedata os tempos bíblicos, embora sem conhecer o mecanismo das reações envolvidas (HARGER et al, 1982). As amilases são as enzimas de maior utilização industrial e de maior importância econômica. Elas são utilizadas para fazer a sacarificação do amido em várias atividades industriais como: panificação, produção de combustíveis, produção de xarope de açúcar, têxtil e papel (PANDEY et al., 2000). A literatura apresenta um grande número de amilases de origem microbiana, no entanto, a α-amilase, β-amilase e glicoamilase são as mais descritas na literatura e mais produzidas. A α-amilase (1,4-a-glucan- 4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1.) é uma enzima que quebra as ligações α (1,4) dos polissacarídeos que possuem três ou mais unidades de D- glucose em união α -1,4 (PANDEY et al.,2005). O ataque ocorre na forma não seletiva (tipo endoenzima) sobre .vários pontos da cadeia simultaneamente, sendo que os primeiros produtos da hidrólise são sempre oligossacarídeos de 5 a 7 unidades de glicose. Na Amazônia, a biomassa vegetal morta é rapidamente degradada pela microbiota, sendo que esta última é muito abundante e ativa devido às condições de clima, umidade e substrato (SOUZA et aI., 2003) Urna fonte de microrganismos amilolíticos na Região Amazônica é a mandioca e as etapas do seu processamento para produção de farinha. Mas farinheiras, o substrato amiláceo é encontrado em abundância e propicia o desenvolvimento e manutenção ambiental de microrganismos produtores de amilases. O objetivo deste trabalho é investigar o isolamento e seleção de fungos amilolíticos de resíduo líquido da indústria de farinha (manipueira).

MATERIAL E MÉTODOS: O estudo esta sendo conduzido no Laboratório Microbiota Pró-Saúde, Núcleo Sociedade e ambiente do Grupo de Pesquisa Microbiota Amazônica.Isolamento dos fungos amilolíticos:Aproximadamente 1 mL de amostra de manipueira foi submetido a diluições sucessivas (1x10-1 - 1x10-5) e alíquotas de 100 µL foram plaqueadas em meio de composto de 1,0% amido solúvel; 0,25% peptona e 0,25% extrato de levedura. As placas, incubadas a 35ºC. Ensaios de Crescimento Radial da cultura e investigação de halos de hidrólise em meio sólido foi realizado como descrito por Spier (2005). Foi observando o crescimento radial dos isolados em meio que tinha como principal fonte de carbono amido (1,0% amido solúvel; 0,25% peptona e 0,25% extrato de levedura). A revelação de halos de hidrólise de amido foi feita com uma solução a 1% de amido. Ensaios de quantificação enzimática Umbioprocesso submerso foi conduzido com os isolados, como descrito por GOMES et al., (2005). Em erlenmeyers de 125 mL sendo colocado 20 mL de meio composto por 1,0% amido solúvel; 0,25% peptona e 0,25% extrato de levedura, este foram inoculados com uma alça de cultura microbiana. O bioprocesso ocorreu a 35°C e 150 rpm, por 72 horas. O material fermentado foi centrifugado a 10.000 g, por 10 minutos, sob refrigeração. O sobrenadante foi usado para determinação da atividade enzimática. A atividade da α-amilase foi determinada medindo a concentração de amido pela dosagem de iodo, onde uma unidade de α-amilase será definida como a quantidade de enzima capaz de hidrolisar 10 mg de amido em 30 minutos, PANDEY et al.,( 2005). A atividade amiloglucosidase foi determinada pela através da liberaliberação de açúcares redutores, dosados pelo método DNS como descrito por PANDEY et al (2005).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Isolamento dos fungos amilolíticos A Tabela 1 apresenta a identidade dos isolados fúngicos da Manipueira. Foram realizadas 5 tentativas para o isolamento de fungos amilolíticos. Bactérias Gram Negativas predominaram na maioria dos isolamentos em concentrações de até 1x107 UFC/mL. A sexta tentativa de isolamento resultou no em 20 isolados fúngicos sendo 2 identificados como Aspergillus sp, 1 identificado como Penicillium sp. foram obtidos ( Tabela 1 e Figura 1).Ensaios de Crescimento Radial da cultura: Os isolados obtidos foram inoculados, em triplicata, em placas de petri que continham meio de cultura com principal fonte de carbono amido.Dezessete isolados produziram atividade enzimática, 1B10-5 apresentou o maior índice enzimático (3,06), ou seja, maior relação do tamanho do halo em relação ao diâmetro da cultura e portanto demonstra ser o isolado com maior potencial amilolítico.Trabalhos com o objetivo de isolar fungos amilolíticos de mandioca processada ou não, no Estado do Amazonas, são poucos. Entre esses, Mourão (2009), como objetivo analisar a produção de enzimas por bactérias endofíticas isoladas de mandioca, avaliou atividade enzimática pelo diâmetro do halo de hidrólise do amido em meio de cultura e observou que, dos 22 isolados obtidos, 35 % apresentaram degradação de amido com diâmetros dos halos de hidrólise pela amilase variaram entre 1,5 - 2,1 cm.Quanto à atividade dextrinizante (alfa- amilase), todos os isolados foram capazes de produzir essa enzima entre 2-36 UI/L. Os principais produtores foram os isolados 6V-4 (36,2± 6,6), 7V-4(32,5± 0,3), 10V-5(32±0,1) e 1B10-5(28± 2)Quanto à atividade sacarificante (amiloglucosidase), a metodologia de detecção permitiu quantificar atividade de somente 5 isolados fúngicos. Essa atividade variou entre 7-83 UI/L.

Figura 1– Macromorfologia dos isolados

Foram realizadas 5 tentativas para o isolamento de fungos amilolíticos.

Figura 2 . O isolado 1B10-5 apresentou o maior índice enzimático

Dezessete isolados produziram atividade enzimática, 1B10-5 apresentou o maior índice enzimático (3,06).

CONCLUSÕES: A metodologia de isolamento utilizada neste trabalho foi satisfatória para o isolamento de fungos amiloticos da farinha de manipueira e alguns dos isolados apresentaram potencial biotecnológico.

AGRADECIMENTOS: Agradecemos as fontes financiadoras: CNPQ /INPA / MCT

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: A. PANDEY, C. R; D. MITCHELL 2000. New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products, Process Biochem.35: 1153-1169. Article I PDF (148 K) I View Record in Scopus] Cited By in Scopus (288).

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COSTA , S.T.C. Atividade amilolitica de leveduras isoladas de batata-doce (Ipomoea batatas (L.) Lam) 2011. Revista Biociência Unital. Vol.17 - nº 2 .

GOMES , E ; SOUZA, S. R. ; GRANDI, R. P. ; SILVA, R. 2005. Production of Thermostable Glucoamylase by Newly Isolated Aspergillus Fllavus A1.1 and Thermomyces Lanuginosus A13.37. Brasilian Journal of Microbiology, v 36, p 75-82.

MOURÃO, L.P.S. 2009. Análise qualitativa da produção de enzimas por bactérias endofílicas isoladas de mandioca (Manihot esculenta Crantz - Euphorbiacea).61ª Anual da SBPC .

PANDEY, A; WEBB, C.; SOCCOL, C.R.; LARROCHE, C. 2005. Enzyme Technology. 1aed. New Delhi: Asiatech Publishers, Inc, p 760.