ÁREA: Materiais
TÍTULO: Desempenho do bioeletrodo para diagnóstico da meningite: Estudo de interferentes e estabilidade
AUTORES: Castro, A.C.H. (UFU) ; Alves-balvedi, R.P. (UFU) ; Cuadros-orellana, S. (FIOCRUZ) ; Coimbra, R. (FIOCRUZ) ; Madurro, J.M. (UFU) ; Brito-madurro, A.G. (UFU)
RESUMO: A meningite meningocócica (MM), causada pela bactéria Neisseria meningitidis
possui um lugar de destaque em todo o mundo, devido a sua gravidade, sendo uma
importante causa de morbidade e mortalidade. Biossensor eletroquímico de DNA é uma
promissora técnica de análise de ácidos nucléicos por causa de sua detecção em
tempo real, elevada sensibilidade e baixo custo. Neste trabalho investigamos o
comportamento eletroquímico do bioeletrodo construído usando oligonucleotideos
sintéticos específicos para um dos agentes etiológicos da meningite, a bactéria
Neisseria meningitidis em eletrodos de grafite modificados eletroquimicamente com
poli (4-aminofenol) (4-AMF) frente a possíveis interferentes, bem como sua
estabilidade por meio de voltametria de pulso diferencial.
PALAVRAS CHAVES: poli (4-aminofenol); meningite meningocócica; hibridização
INTRODUÇÃO: A Meningite é a inflamação das membranas que recobrem o sistema nervoso central
e é comumente causada por agentes infecciosos podendo ser causada por vírus ou
bactérias. A forma viral geralmente é benigna e de curso auto-limitado. A forma
bacteriana é grave, podendo resultar em danos ao cérebro, perda de audição ou
dificuldade de aprendizagem, com altas taxas de mortalidade e morbidade. O
diagnóstico da meningite é realizado por meio de imunoaglutinação em látex,
raio X, tomografia computadorizada, ressonância magnética e reação em cadeia da
polimerase. Estes testes são demorados, de elevado custo, demanda mão obra
especializadas e não-confirmativos (PATEL et al; 2009).
Biossensor eletroquímico de DNA é uma promissora técnica de análise de ácidos
nucléicos por causa de sua detecção em tempo real, elevada sensibilidade e baixo
custo (SILVA et al; 2009). Esta técnica utiliza sequências de DNA imobilizado na
superfície do sensor como elemento de reconhecimento e sequências de
hibridização específicas podem ser monitoradas e analisadas.
Neste trabalho investigamos o comportamento eletroquímico do bioeletrodo
construído usando oligonucleotideos sintéticos específicos para um dos agentes
etiológicos da meningite, a bactéria Neisseria meningitidis em eletrodos de
grafite modificados eletroquimicamente com poli(4-AMF) frente a possíveis
interferentes, bem como sua estabilidade por meio de voltametria de pulso
diferencial, utilizando o brometo de etidio como mediador, para a análise em
fluidos biológicos.
MATERIAL E MÉTODOS: A polimerização eletroquímica e as medidas voltamétricas foram realizadas em
células de um e três compartimentos, acoplados a um potenciostato CH Instruments
420A. Um disco de grafite com 6 mm de diâmetro foi obtido a partir de um bastão
de grafite com 99.9995% de pureza e utilizado como eletrodo de trabalho. Platina
foi utilizada como contra eletrodo e como eletrodo de referência eletrodo de
prata-cloreto de prata (Ag/AgCl (KCl 3M)). Todos os experimentos foram
realizados à temperatura ambiente.
A solução de 4-AMF foi deaerada com nitrogênio ultra puro por 45 minutos antes
da eletropolimerização, que foi realizada sobre um eletrodo de grafite com
ciclos contínuos do potencial de acordo com Vieira e colaboradores (Vieira et
al; 2006).
Os fragmentos de DNA especifico para a bactéria Neisseria meningitidis usados na
construção do bioeletrodo foi sintetizado pela Alpha DNA (Canada) com a
seqüência (NM1) 5'-TGTTGGGCAACCTGATTG-3’. A solução foi preparada em tampão SSC
(Cloreto de sódio 0.3 mol.L-1, Citrato de sódio 0.03 mol.L-1), na concentração
de 0.063x10-3 mol.L-1 e gotejada sobre o eletrodo modificado com 4-AMF, que
depois é imerso em solução de albumina bovina do soro 0,5%( alnumina bovina),
por 2 horas.
Para fins de diagnóstico em amostras de sangue, o bioeletrodo foi avaliado
frente aos interferentes normalmente presentes no sangue humano. Nos testes
foram usados: alanina (1mM), glicose(1mM), glutamato(1mM), ácido úrico (1mg.dL-1
) e ácido ascórbico (3.6 mg.dL-1 ). A estabilidade foi conduzida por um período
de 120 dias. O brometo de etídio foi utilizado como intercalante do DNA, nas
detecções eletroquímicas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Na análise de fluidos biológicos, sinais podem ser gerados devido a
níveis fisiológicos de espécies eletroativas tais como ácido ascórbico, ácido
úrico, uréia, albumina e outros, afetando a seletividade do sistema. Diante
deste contexto, possíveis interferentes da resposta do genossensor foram
avaliados, conforme indicado na figura 1.
O coeficiente de seletividade (CS) do bioeletrodo foi calculado usando
a equação: CS = Ic+i / Ic, onde Ic e Ic+i é a resposta do genossensor na
presença ou ausência do interferente, respectivamente (SAXENA et al; 2011). Os
resultados obtidos indicam que a resposta do bioeletrodo não é afetada
significativamente na presença dos interferentes, indicando uma elevada
seletividade na detecção da meningite.
O estudo de estabilidade do genossensor é um fator crítico no contexto
de sua aplicação farmacêutica e industrial. A figura 2 mostra o gráfico de
estabilidade de poli (4-AMF):NM1, mantidos a uma temperatura de 8ºC durante seu
armazenamento.
O genossensor manteve 93% de seu valor inicial após 120 dias de
armazenamento, usando brometo de etídio como indicador do processo de
hibridização.
Figura 1
Figura 2
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos indicam que o bioeletrodo produzido foi eficiente para
a detecção de fragmentos de DNA específicos para a meningite sem sofrer
interferência significativa de compostos existentes nos fluidos biológicos e se
mostrou estável por 120 dias. Estes resultados são promissores para o
desenvolvimento de biossensores com DNA para diagnóstico de doenças.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem a CAPES, FAPEMIG e PROPP-UFU pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: PATEL M.K., SOLANKI P.R., SETH S.,GUPTA S., KHARE S., KUMAR A., MALHOTRA B.D. “CtrA gene based electrochemical DNA sensor for detection of meningitis". Electrochemistry Communications; 11, 969-973, 2009.
SILVA T.A.R.; FERREIRA L.F.; SOUZA L.M.; GOULART L. R.; MADURRO J.M.; BRITO-MADURRO A.G. “New approach to immobilization and specific-sequence detection of nucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid) ". Materials Science and Engineering:C, 29, 539, 2009.
VIEIRA, S.N.; FERREIRA, L.F.; FRANCO, D.L.; AFONSO, A.S.; GONCALVES, R.A.; BRITO-MADURRO, A.G.; MADURRO, J.M. Electrochemical modification of graphite electrodes with poly(4-aminophenol), Macromolecular Symposia 245-246, 236-242, 2006.
SAXENA, U.; CHAKARABORTY, M.; GOSWAMI, P. Covalente immobilization of cholesterol oxidade on self-assembled gold nonoparticulas for highly sensitive amperometric detection of cholesterol in real samples. Biosensors and Bioelectronics
26, 3037-3043, 2011.
