ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA DE Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO AZUL DE METILENO E DOIS SISTEMAS DE IRRADIÇÃO
AUTORES: Costa, N.J.S. (UFU) ; Melo, G.F. (UFU) ; Hilario, M.A.S. (UFU) ; Garcês, B.P. (UFU) ; Oliveira, C.A. (UFU)
RESUMO: A Terapia Fotodinâmica é uma técnica alternativa de tratamento de tumores e
inativação de microrganismos. Esse método é constituído pela injeção de um
fotossensibilizador que quando exposto à luz, com um comprimento de onda
adequado, é ativado, transferindo energia para o oxigênio molecular que se
transforma em oxigênio singlete e outros radicais livres. Essas espécies
desencadeiam reações químicas que inativam a célula. Neste trabalho comparou-se
a fototoxicidade do azul de metileno irradiado no aparelho WE-IV, que
fotossensibiliza a droga em todo espectro visível, no LED600, com comprimento de
onda de 650 nm, e na ausência de luz. O equipamento LED600 se mostrou mais
eficiente na inativação fotodinâmica devido ao seu comprimento de onda de
emissão ser muito próximo ao comprimento máximo.
PALAVRAS CHAVES: terapia fotodinâmica; azul de metileno; Saccharomyces cerevisiae
INTRODUÇÃO: A Terapia Fotodinâmica (do inglês Photodynamic Therapy ou PDT) tem sido
utilizada para o tratamento de vários tipos de câncer e doenças não-oncológicas.
Essa modalidade terapêutica tem sido utilizada sobre os outros tratamentos
convencionais pela baixa toxicidade sistêmica, além de ser minimamente invasiva.
A PDT combina um fotossensibilizador, que tenha seletividade e alta afinidade
por células malignas, com luz visível em comprimento de onda adequado. Quando o
fotossensibilizador acumula no tecido anormal, a luz ativa o mesmo, que
transfere energia para o oxigênio molecular produzindo um estado excitado, o
oxigênio singlete, que é altamente reativo. Essa transferência de energia ocorre
diretamente ao oxigênio ou por meio de espécies de radicais. A alta reatividade
do oxigênio singlete é responsável pela citotoxidade das células anormais. A
levedura Saccharomyces cerevisiae foi usada nesse trabalho devido à facilidade
de obtenção e manuseio e principalmente pela semelhança entre seu metabolismo
com o de células humanas com características cancerígenas. O fotossensibilizador
utilizado foi o azul de metileno, devido a sua metabolização rápida,
fotossensibilidade não prolongada e por ser um corante catiônico, facilitando a
entrega das drogas às células-alvo. Os sistemas de irradiação utilizados na
inativação da S. cerevisiae foi o LED600, um aparelho com 600 diodos de
emissores de luz que irradia em um comprimento de onda de 650 nm, e o WE-IV, que
consiste em um arranjo de 4 lâmpadas fluorescente de 20 W cada, ambos
construídos no próprio laboratório.
MATERIAL E MÉTODOS: Neste trabalho foi utilizado o método de microdiluição para avaliar a
fotoinativação de Saccharomyces cerevisiae utilizando azul de metileno. Nesse
método é utilizado uma placa de microdiluição de 96 poços onde a droga com
concentração inicial de 0,5 mM é diluída em 100µL de água estéril, até atingir
concentração de 0,015 mM. A suspensão de leveduras (100µL) é colocada logo em
seguida em sua concentração original e em diluições de 1/10, 1/100 e 1/1000.
Esse procedimento foi feito em 3 placas diferentes, sendo deixadas incubando
durante 20 minutos, para que a droga possa interagir com a levedura. Para
determinar a atividade citotóxica e fototóxica do azul de metileno sobre
Saccharomyces cerevisiae, uma das placas foi irradiada no LED600 em um
comprimento de onda de 650 nm e a outra na WE-IV, que apresenta luz branca, onde
o fotossensibilizador é excitado em toda região visível, durante 30 minutos,
sendo que a última placa não foi irradiada para fins de comparação. O caldo
utilizado como meio líquido nutritivo foi o BHI (Brain Heart Infusion) tendo
como constituintes a peptona, fonte de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas,
e a dextrose, que é um carboidrato que os microrganismos utilizam para
fermentação. Desse caldo foi colocado 100µL em cada poço. As três placas foram
deixadas na estufa durante 48 horas em uma temperatura constante de 37 °C. A
resazurina que é um corante utilizado como um indicador de oxidação-redução foi
injetado (10µL) em cada poço no intuito de revelar se houve inibição ou não da
S. cerevisiae. As placas foram colocadas na estufa novamente por um período de 2
horas. Essa inibição é vista através da mudança de cor, sendo que rosa indica
crescimento da levedura e azul, morte.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A placa irradiada no LED600 apresentou bons resultados, tendo como concentração
inibitória mínima da fotoinativação de Saccharomyces cerevisiae utilizando azul de
metileno de 0,06125 mM, sendo utilizado o comprimento de onda de 650 nm, indicando
que nessas condições o azul de metileno é fototóxico. Na ausência de luz e na
irradiação no WE-IV a morte celular ocorreu apenas para concentrações superiores a
0,5mM. Foi observada a mesma mortalidade celular para todas as concentrações do
inóculo, pois o corante resazurina é bastante sensível, havendo mudança de
coloração mesmo com pouca população de células. Uma avaliação pelo método das
unidades formadoras de colônia seria necessária para determinar quantitativamente
a mortalidade celular.
CONCLUSÕES: O azul de metileno se mostrou eficiente como fotossensibilizador para a inativação
fotodinâmica do fungo exposto a irradiação do LED600, indicando que é um composto
fototóxico. Porém, não é citotóxico na ausência de luz e na irradiação de luz
branca. Sendo assim, a inativação fotodinâmica da Saccharomyces cerevisiae
utilizando azul de metileno é mais eficiente quando o fotossensibilizador é
irradiado com uma luz na região do vermelho do espectro visível, sendo o
comprimento de onda maior ou igual a 600 nm.
AGRADECIMENTOS: Agradecemos à CNPq, FAPEMIG, CAPES e IQUFU.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: DIAZ-RUIZ, R. et al.; Biochimica et Biophysica Acta, 19807 (2001) 568-576.
ORTEL, B.; SHEA, C. R.; CALZAVARA, P. P. Molecular mechanisms of photodynamic therapy, v. 14, p. 4157-4172, 2009.
