ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Estudo voltamétrico da atividade biológica da lectina de Cratylia mollis para o desenvolvimento de um biodispositivo nanoestruturado para Dengue.
AUTORES: Avelino, K.Y.P.S. (UFPE) ; Andrade, C.A.S. (UFPE) ; de Melo, C.P. (UFPE) ; Correia, M.T.S. (UFPE) ; Coelho, L.C.B.B. (UFPE) ; Nogueira, M.L. (FAMERP) ; Oliveira, M.D.L. (UFPE)
RESUMO: O presente trabalho possui como principal objetivo avaliar o comportamento
biológico da lectina de Cratylia mollis, imobilizada em nanopartículas de ouro e
polianilina (AuNpPANI), frente a glicoproteínas do vírus da Dengue presentes nos
sorotipos DS1, DS2 e DS3. A caracterização do biossistema foi realizada através da
Voltametria Cíclica (VC) e, em adição, os tamanhos das partículas foram
determinados através do método de espalhamento de luz. Os resultados demonstraram
que a CramoLL reteve sua atividade biológica quando adsorvida em AuNpPANI, havendo
a formação de complexos AuNpPANI-CramoLL-glicoproteínas DS1, DS2 ou DS3. Portanto,
verifica-se o grande potencial de aplicabilidade da lectina Cra e do nanocompósito
AuNpPANI para o desenvolvimento de um biodispositivo para detecção da Dengue.
PALAVRAS CHAVES: Voltametria Cíclica; Biossensor; Dengue
INTRODUÇÃO: O vírus da Dengue de RNA-fita simples de polaridade positiva pertence ao gênero
Flavivirus e família Flaviviridae. O genoma viral codifica proteínas não-
estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) expressas na superfície da
célula infectada ou no espaço extracelular. Em especial, a glicoproteína NS1 por
ser altamente conservada e possuir propriedades antigênicas, está sendo
amplamente estudada como molécula de determinação para o diagnóstico da Dengue
(HOBER et al., 1995). Os Biossensores são dispositivos analíticos constituídos
por um biorreceptor associado a um transdutor capaz de converter a resposta
bioquímica em um sinal elétrico (HULANICKI; GEAB; INGMAN, 1991). A lectina
CramoLL, isolada a partir de sementes de Cratylia mollis, são consideradas
ferramentas úteis para o isolamento e caracterização de glicoproteínas (SHARON;
LIS, 2004) por possuírem sítios específicos para resíduos de manose / glicose
(CORREIA; COELHO, 1995). No desenvolvimento de biossensores, a adsorção direta
de biomoléculas em superfícies metálicas pode ocasionar a perda ou diminuição de
sua atividade biológica. Desta forma, nanocompósitos biofuncionalizados, como as
nanopartículas de ouro e polianilina, por apresentarem características
elétricas, ópticas e físico-químicas únicas, são empregados como camadas
intermediárias para imobilização de biocomponentes (LI; SCHLUESENER; XU, 2010).
O presente estudo possui como objetivo avaliar o processo adsortivo da lectina
CramoLL em eletrodo de ouro modificado e analisar a resposta do biodispositivo
após a interação com os sorotipos 1, 2 e 3 da Dengue. Atualmente, por a Dengue
ser um grave problema de saúde pública, é de grande interesse o desenvolvimento
de novas tecnologias de detecção, como os biossensores (CAYGILL; BLAIR; MILLNER,
2010).
MATERIAL E MÉTODOS: O instrumento utilizado para determinação dos tamanhos das partículas foi o
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK). As soluções de estudo foram
acondicionadas em uma cubeta e avaliadas em um total de três repetições. As
medidas voltamétricas foram realizadas em um Potenciostato AUTOLAB 302N, numa
célula eletroquímica convencional de três eletrodos imersos em 10 mL de solução
de ferro-ferricianeto de potássio (1:1) a 10 mM, atuando como sonda redox. O
eletrodo de trabalho utilizado foi o eletrodo de ouro modificado, o eletrodo de
referência foi o de Ag/AgCl saturado com KCl e o de contra-referência foi o de
platina. As análises de Voltametria Cíclica foram realizadas em diferentes
etapas de construção do biodispositivo, a um potencial de -0,4 a 0,7 V e
velocidade de varredura de 50 mv/s, a temperatura ambiente e no interior de uma
gaiola de Faraday. Primeiramente, a superfície eletroativa de ouro foi polida em
um disco de feltro com uma suspensão de alumina e, em seguida, lavada
abundantemente com água deionizada e submetida à sonicação por 5 minutos para
remoção de partículas residuais. Para a montagem do biossensor, o disco de ouro
do eletrodo de trabalho foi imerso por 2 minutos no sistema AuNpPANI-Cra
constituído por nanocompósito híbrido diluído em etanol (1:10) e lectina CramoLL
(200 µg/mL) em uma proporção 2:1 (v/v). Após a obtenção do eletrodo
biossensível, este foi incubado por 2 minutos nos soros de pacientes com Dengue
tipo 1, 2 e 3, e posteriormente, enxaguado suavemente para separação das
moléculas não reconhecidas. Estes sorotipos foram previamente diluídos em
solução tampão fosfato de sódio a 10 mM e pH 7,4; numa proporção 1:10 (v/v).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Através da determinação de tamanho das partículas (Fig.1), foi observado que o
biossistema AuNpPANI-Cra apresentou um menor tamanho médio (1459 nm) em relação
as amostras contendo os sorotipos DS1 (2669 nm), DS2 (2975,3 nm) e DS3 (3502,16
nm). Estas medidas indicam que a lectina de Cratylia mollis se ligou a
glicoproteínas anormais ocasionando a formação de aglomerados evidenciados pelo
aumento do diâmetro médio dos complexos. Por meio da voltametria cíclica foram
obtidas informações sobre os processos de modificação da superfície do eletrodo
e as interações específicas do biossistema. A partir dos voltamogramas para o
eletrodo de ouro limpo, eletrodo modificado com AuNpPANI-Cra e AuNpPANI-Cra-DS1,
DS2 ou DS3 foi observado uma diminuição gradual das áreas voltamétricas, cujas
curvas tornaram-se menos sigmoidais (Fig.2). A cada etapa de construção do
biodispositivo, houve a redução das correntes de pico catódicas e anódicas,
refletindo o aumento da resistência da interface eletrodo-solução ao fluxo de
elétrons, consequência do reconhecimento biológico da lectina CramoLL. Foi
verificado que o biossensor apresentou uma maior sensibilidade para o sorotipo
DS3, seguido do DS1 e DS2. Ao relacionar os resultados experimentais com os
dados de outros trabalhos observa-se que nossos resultados estão em concordância
com estudos prévios. Como por exemplo, segundo Oliveira et al. (2011) a lectina
de Cratylia mollis quando imobilizada em matriz de tetróxido de ferro e
polivinil butiral apresenta afinidade para glicoproteínas virais. Portanto,
pode-se observar que uso o de lectinas para o desenvolvimento de biossensores
apresenta aplicabilidade na detecção de patologias baseado no processo de
interação lectina-carboidrato.
Figura 1.
Tamanho das partículas em solução. Amostra 1:
AuNpPANI-Cra; Amostra 2: AuNpPANI-Cra-DS1; Amostra
3: AuNpPANI-Cra-DS2 e Amostra 4: AuNpPANI-Cra-DS3.
Figura 2.
Voltamogramas cíclicos das diferentes etapas de
modificação do eletrodo de ouro e da interação do
biossistema AuNpPANI-Cra com os sorotipos de Dengue.
CONCLUSÕES: A partir das informações experimentais, pode-se concluir que a lectina CramoLL
adsorvida em superfície de metálica modificada com nanocompósito de ouro e
polianilina possui excelente capacidade de reconhecimento biológico. O biossistema
AuNpPANI-Cra apresentou boa reprodutibilidade e seletividade para glicoproteínas
dos sorotipos DS1, DS2 e DS3, portanto, poderá ser utilizado para a construção de
um método diagnóstico mais sensível, de análise rápida e com menos custos para
Dengue.
AGRADECIMENTOS: CNPq, CAPES-Rede nanobio/ELINOR, FACEPE.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: CAYGILL, R.L.; BLAIR, G.E.; MILLNER, P.A. 2010. A review on viral biosensors to detect human pathogens. Analytica Chimica Acta, 681: 8-15.
CORREIA, M.T.S.; COELHO, L.C.B.B. 1995. Purification of a glucose/mannose specific lectin, isoform 1, from seeds of Cratylia mollis Mart. (Camaratu Bean). Applied Biochemistry and Biotechnology, 55: 261-273.
HOBER, D.; ROULIN,G.; DEUBEL, V.; WATTRE, P. 1995. La dengue: une maladie virale en pleine expansion. Méd. Mal. Infect., 25: 888-895.
HULANICKI, A.; GEAB, S.; INGMAN, F. 1991. Chemical sensors: definitions and classification. Pure & Appl. Chem., 63: 1247-1250.
LI, Y.; SCHLUESENER, H.J.; XU, S. 2010. Gold nanoparticle-based biosensors. Gold Bulletin, 43: 29-41.
OLIVEIRA, M.D.L.; NOGUEIRA M.L.; CORREIA, M.T.S.; COELHO, L.C.B.B.; ANDRADE, C.A.S. 2011. Detection of dengue virus serotypes on the surface of gold electrode based on Cratylia mollis lectin affinity. Sensors and Actuators B, 155: 789-795.
SHARON, N.; LIS, H. 2004. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. Glycobiology, 14: 53-62.
