52º CBQ - Comparação entre dois ensaios enzimáticos na detecção de inibição da tripsina de lagarta-do-cartucho do milho em cromatografia preparativa

ÁREA: Produtos Naturais

TÍTULO: Comparação entre dois ensaios enzimáticos na detecção de inibição da tripsina de lagarta-do-cartucho do milho em cromatografia preparativa

AUTORES: Ramos, V.O. (UFLA) ; Bastos, V.A.A. (UFLA) ; Braga, M.A. (UFLA) ; Simão, A.A. (UFLA) ; Alves, A.P.C. (UFLA) ; Guedes, M.N.S. (UFLA) ; Santos, C.D. (UFLA)

RESUMO: Buscando purificar o inibidor da tripsina de Spodoptera frugiperda presente na farinha de folhas de mamona (FFM) foram realizadas duas cromatografias utilizando sílica Merck como fase estacionária. A coluna foi equilibrada com etanol 45% antes da aplicação do extrato, cujos volumes aplicados foram 0,1 e 0,5mL, eluídos com água deionizada. A primeira corrida teve o inibidor detectado pelos sistemas de ensaios 1 e 2 (cinético e não cinético, respectivamente). A segunda corrida apresentou um pico característico de inibição seguido de cauda, provavelmente devido à sobrecarga da coluna ou ainda devido as característica polares deste inibidor. O ensaio 2 se mostrou confiável para a detecção e foi possível inferir que sílica não é a melhor fase estacionária para esta de purificação.

PALAVRAS CHAVES: Inibição enzimática; Ricinus communis; Purificação

INTRODUÇÃO: Nos últimos anos, os produtores de milho têm enfrentado dificuldades em combater uma das pragas que mais lhes causam prejuízos, Spodoptera frugiperda (Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), conhecida como lagarta-do-cartucho. No Brasil as perdas podem chegar a 47,27% da produção de matéria seca e 54,49% no rendimento de grãos. O manejo adequado desta praga na lavoura é crucial para redução de danos. O controle da S. frugiperda tem sido frequentemente realizado por meio da aplicação de inseticidas, que geralmente causam desequilíbrios biológicos, intoxicação dos aplicadores e contaminação ambiental (FIGUEIREDO et al., 2006; MENDEZ et al., 2002). O uso de extratos vegetais visando o controle da lagarta-do-cartucho é considerado promissor, visto que as plantas se defendem do ataque de insetos e de outros organismos através de inúmeros mecanismos, dentre os quais se destacam a síntese e o acúmulo de proteínas de defesa tais como os inibidores de proteinases (IP). Desde a descoberta dos IP como agentes de defesa vegetal, inúmeras tentativas têm sido feitas para a sua utilização no melhoramento vegetal. (MOSOLOV e VALUEVA, 2008). O uso de IP como meio de controle de S. frugiperda tem sido foco de diversos estudos, como os desenvolvidos por Brioschi et al. (2007) e Paulillo et al. (2000). Os inibidores de tripsina descritos na literatura normalmente são de origem protéica (BENCHABANE et al., 2010), diferentemente do inibidor encontrado em folhas de mamona, uma molécula orgânica de certa polaridade com estrutura molecular ainda desconhecida (ROSSI et al., 2010). Diante do exposto, objetivou-se neste trabalho utilizar cromatografia flash com detecção por dois ensaios enzimáticos como etapa preparatória no isolamento do inibidor de tripsina presente em folhas de mamona.

MATERIAL E MÉTODOS: Folhas de mamoninha do caule vermelho (Ricinus communis L.), de ocorrência espontânea no campus da Universidade Federal de Lavras, foram coletadas, lavadas com água destilada e secas em estufa com ventilação forçada, a 45ºC. Em seguida foram trituradas em moinho Tecnal TE-631, e a farinha de folhas de mamona (FFM) obtida armazenada em frascos escuros hermeticamente fechados à temperatura ambiente até as análises. Foram realizados dois ensaios de inibição de tripsina: 1- ensaio cinético e 2- ensaio não cinético, conforme metodologia proposta por Kakade et al. (1974). A inibição foi expressa em percentagem em relação ao controle e os gráficos plotados em % de inibição versus fração obtida. Os parâmetros utilizados na extração do inibidor de FFM foram proporção 1:33,1(p:v) de etanol 45% a 40ºC por 60 minutos, após centrifugação o precipitado sofreu re-extração nas mesmas condições. Uma coluna de vidro com 50 cm de comprimento por 3 cm de diâmetro foi preenchida com sílica gel 60 Merck 0,04-0,063 mm. Uma massa de sílica de 48,77g foi calculada para preencher apenas 15 cm de coluna, aos quais foram adicionados clorofórmio suficiente para que a mistura se tornasse fluida. Verteu-se a mistura dentro da coluna tomando-se o cuidado de não haver a formação de bolhas na fase estacionária (Collins, 2006). A coluna foi equilibrada com etanol 45% antes da aplicação do extrato. Foram aplicados no topo da coluna 0,1 e 0,5 mL do extrato, sendo este eluídos com água deionizada com auxilio de uma bomba a 0,5 kgf/cm³ de pressão. As frações de 20 mL foram concentradas em rotoevaporador até 5 mL e então utilizadas nos ensaios de inibição.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os perfis de eluição na Figura 1 apresentaram pouca divergência entre si. O ensaio 1 de inibição de tripsina é mais confiável por se tratar de um ensaio cinético com 4 tempos de reação, o que permite o cálculo da porcentagem a partir da diferença entre as inclinações da reta controle e as retas das frações obtidas, contudo, este método é demorado e consome grande quantidade de regentes e amostra. O ensaio 2 de inibição de tripsina detectou o inibidor presente nas frações e o perfil de eluição 2 gerado seguiu o mesmo comportamento do perfil de eluição 1, indicando que o ensaio 2 pode ser utilizado na detecção de inibição em frações cromatográficas, gerando assim menor ônus ambiental. A segunda cromatografia foi realizada com 5 vezes mais amostra, buscando obter- se grande quantidade do inibidor para análise em HPLC e posterior identificação desse inibidor. Observou-se (Figura 2) formação de cauda no cromatograma, provavelmente devido as característica polares deste inibidor (CARVALHO, 2009; ROSSI, 2010; RAMOS, 2012), que pode causar maior permanência na fase estacionária e perda da resolução. Outro motivo para este comportamento pode ser a sobrecarga da coluna com a quantidade de amostra aplicada, o que também pode causar perda de resolução. Contudo, este tipo de cromatografia preparativa se mostrou útil nas etapas iniciais de purificação do inibidor de tripsina de mamona.

Figura 1

Comparação entre a detecção da inibição por dois ensaios

Figura 2

Cromatografia preparativa do extrato etanólico de folhas de mamona

CONCLUSÕES: Os ensaios enzimáticos se mostraram confiáveis na detecção de inibição em frações obtidas em cromatografia flash preparativa, sendo indicado o uso da metodologia proposta por Kakade et al. (1974) por sua facilidade e menor custo. Este tipo de cromatografia preparativa pode ser utilizado nas etapas iniciais de identificação do inibidor de tripsina presente na FFM, desde que sejam tomados cuidados com a quantidade de amostra aplicada.

AGRADECIMENTOS: À FAPEMIG, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro e a UFLA por todo suporte.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BENCHABANE, M. et al. Plant cystatins. Biochimie, 92, 11, 1657-1666, 2010
BRIOSCHI, D. et al. General up regulation of Spodoptera frugiperda trypsins and chymotrypsins allows its adaptation to soybean proteinase inhibitor. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 37, 12, 1283-1290, 2007.
CARVALHO, G. Extração e análises cromatográficas de um inibidor de tripsina presente em folhas de mamona e sua ação no desenvolvimento da lagarta-do-cartucho do milho. Lavras: UFLA, 2009. Dissertação (Mestrado em Agroquímica), Universidade Federal de Lavras, 2009.
COLLINS, C. H. ; BRAGA, G. L. ; BONATO, P. S. Fundamentos de cromatografia. Campinas: UNICAMP, 2006.
ERLANGER, B. F. ; COHEN, W. ; KOKOWSKY, N. Preparation and properties of 2 new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry and Biophysics. 95, 2, 1961.
FIGUEIREDO, M. D. L. C. ; MARTINS-DIAS, A. M. P. ; CRUZ, I. Relationship between fall armyworm and their natural biological control agents in the maize crop. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, . 41, 12, 1693-1698, 2006.
KAKADE, M. L. et al. Determination of trypsin-inhibitor activity of soy products - collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chemistry, 51, 3, 376-382, 1974
MENDEZ, W. A. et al. Spinosad and nucleopolyhedrovirus mixtures for control of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera : Noctuidae) in maize. Biological Control, 25, 2, 195-206, 2002.
MOSOLOV, V. V. ; VALUEVA, T. A. Proteinase inhibitors in plant biotechnology: A review. Applied Biochemistry and Microbiology, 44, 3, 233-240, 2008.
PAULILLO, L. et al. Changes in midgut endopeptidase activity of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera : Noctuidae) are responsible for adaptation to soybean proteinase inhibitors. Journal of Economic Entomology, 93, 3, 892-896, 2000.
RAMOS, V. O. Isolamento de inibidores de tripsina de sementes de mamona e sua ação sobre o desenvolvimento de Spodoptera frugiperda (Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). Lavras : UFLA, 2012. Dissertação (Mestrado em Agroquímica), Universidade Federal de Lavras, 2012.
ROSSI, G. D. et al. Coffee leaf miner trypsin inhibition with castor bean leaf extracts mediated by a non-protein agent. Ciencia E Agrotecnologia, 34, 2, 361-366, 2010.