ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: Métodos quimiométricos aplicados à extração de inibidores de tripsina em farinha de folhas de mamona (Ricinus communis)
AUTORES: Ramos, V.O. (UFLA) ; Braga, M.A. (UFLA) ; Marquez, T.R. (UFLA) ; Simão, A.A. (UFLA) ; Queiroz, E.R. (UFLA) ; Santos, C.D. (UFLA)
RESUMO: O uso de plantas como fonte de moléculas com efeito benéfico às atividades humanas
é tema recorrente em diversas áreas do conhecimento, contudo, o modo como estes
compostos podem ser extraídos pode influenciar sua utilização. Buscando
compreender melhor este comportamento, avaliou-se neste estudo o efeito da
proporção e do solvente utilizado na extração do inibidor de tripsina encontrado
em farinha de folhas de mamona (FFM) através de um planejamento composto central
2². A análise de variância mostrou que houve diferença significativa entre os
experimentos, onde foi obtida uma inibição de tripsina de 59542,43 mUTI/g de FFM e
a superfície de resposta indicou que etanol 45% e a proporção 1:33,1 (p:v) são as
melhores condições a serem utilizadas na extração do inibidor de tripsina de FFM.
PALAVRAS CHAVES: Otimização; Análise multivariada; Spodoptera frugiperda
INTRODUÇÃO: O controle da Spodoptera frugiperda tem sido frequentemente realizado por
meio da aplicação de inseticidas, que geralmente causam desequilíbrios
biológicos, intoxicação dos aplicadores e contaminação ambiental. O uso de
extratos vegetais visando o controle da lagarta-do-cartucho é considerado
promissor, visto que as plantas se defendem do ataque de insetos através de
inúmeros mecanismos, dentre os quais se destacam a síntese e o acúmulo dos
inibidores de proteinases (IPs) (MOSOLOV e VALUEVA, 2008).
Os inibidores de tripsina normalmente são de origem protéica, diferente do
inibidor encontrado em folhas de mamona, uma molécula polar com estrutura
molecular ainda desconhecida. Os mecanismos de inibição para alguns IPs já foram
descritos, porém, ainda não se sabe ao certo como um inibidor não protéico
influencia proteólise. Entender como este mecanismo funciona pode ajudar no
controle de S. frugiperda (BENCHABANEet al, 2010; ROSSI et al, 2010).
Uma das etapas críticas em qualquer experimento é o preparo da amostra. Em se
tratando de análises que envolvam extração as variáveis são muitas (Ong, 2004),
e a determinação das melhores condições normalmente é a etapa mais laboriosa
neste tipo de trabalho.Como estratégia de redução no tempo de análise e cuidado
ambiental, a utilização de métodos multivariados em quimiometria vem se
destacando, principalmente devido aos resultados rápidos e menor geração de
resíduos pós-análise (TEÓFILO e FERREIRA, 2006).
Neste trabalho, teve-se como objetivo otimizar a extração do inibidor de
tripsina encontrado em folhas de mamona, utilizando o planejamento composto
central 2² (CCD 2²), visto que este inibidor possui especificidade anti-tríptica
para a S.frugiperda, uma das pragas de maior importância econômica na
cultura do milho.
MATERIAL E MÉTODOS: Folhas de mamoninha do caule vermelho (Ricinus communis L.), de
ocorrência espontânea no campus da Universidade Federal de Lavras, foram
coletadas, lavadas com água destilada e secas em estufa com ventilação forçada a
45ºC. Em seguida foram trituradas em moinho Tecnal TE-631, e a farinha de folhas
de mamona (FFM) obtida armazenada em frascos escuros hermeticamente fechados à
temperatura ambiente até as análises.
O ensaio cinético de inibição foi realizado conforme a metodologia descrita por
Ramos (2012), em que uma mili-unidade de tripsina inibida corresponde a 1nmol de
p-nitroanilida que deixa de ser produzido por minuto na presença do inibidor
contido em 1 grama de FFM (mUTI/g).
Os parâmetros fixos definidos nos experimentos de triagem na extração do
inibidor de FFM foram temperatura (40ºC), tempo (60 min) e re-extração (1). Já a
proporção solvente/amostra e otipo de solvente tiveram seus efeitos avaliados de
forma multivariada, utilizando CCD 2².
Para a realização dos experimentos, 100 mg de FFM foram acondicionados em tubos
falcon e em seguida foi adicionado a respectiva proporção do solvente, ambos
determinados pelo planejamento e acondicionados em banho ultrassônico à 40ºC por
60 minutos. Após este período o extrato foi centrifugado e o sobrenadante
recolhido. Foi feita nova adição de solvente na mesma proporção estabelecida e
repetiu-se o processo de extração. Os dois sobrenadantes foram reunidos e
armazenados em frasco de vidro até o momento do ensaio de inibição.
Os resultados em UTI/g do ensaio de inibição foram analisados utilizando as
planilhas desenvolvidas por Teófilo e Ferreira, (2006) para CCD, de onde se
obteve a ANAVA e a superfície de resposta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O número de experimentos realizados, planejamento dos experimentos, valores de
solvente (em %), proporção (p:v) e resposta em mUTI dos experimentos de
otimização utilizando o CCD 2² são mostrados na Tabela 1.
A ANAVA (Tabela 2) indica que, os parâmetros proporção e solvente, tem
influência significativa na extração do inibidor de tripsina de folhas de
mamona. Dentre os extratos, o com etanol 45% na proporção 1:37,4 (p:v) (Tabela 1
- experimento 7) mostrou maior inibição (59542,43 mUTI/g de FFM). Carvalho
(2009) utilizando apenas etanol obteve inibição de 2000 mUTI/g de extrato seco
de folhas de mamona, já Ramos (2012), extraindo o inibidor a partir de torta de
sementes de mamona com água obteve inibição de 795,20 mUTI/g de extrato seco,
valores esses bem inferiores aos obtidos neste trabalho (Tabela 1).
A superfície de resposta (Gráfico 1) indica que a porcentagem de etanol ideal
foi a utilizada no ponto central, (Gráfico 1A,eixo x, α=0 enquanto a proporção
não foi encontrada dentro dos experimentos realizados (Gráfico 1B). Contudo, o
Gráfico 1C possibilitou o cálculo da melhor proporção como sendo 1:33,1 (p:v) a
partir do valor máximo de α=2,25 obtido no eixo y, correspondente ao efeito da
proporção, conforme Tabela 1.
Tabelas
Tabela 1 - Condições para CCD
Tabela 2 - Análise de Variância
Graficos de superfície de resposta
Gráfico A- efeito do eixo x
Gráfico B- efeito do eixo y
Gráfico C- zoom do eixo y para obtenção do valor
de alfa
CONCLUSÕES: O uso de estratégias de planejamento multivariado se mostrou eficaz no preparo de
extratos com atividade anti-tríptica, indicando que essa metodologia pode ser
aplicada em outras análises que envolvam a extração de metabólitos secundários.
Foi possível ainda determinar a melhor forma de extração do inibidor de tripsina,
presente em folhas de mamona, o que facilitará trabalhos futuros de identificação
deste composto.
AGRADECIMENTOS: À FAPEMIG, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro e a UFLA por todo suporte.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BENCHABANE, M. et al. 2010. Plantcystatins. Biochimie, 92: 1657-1666.
CARVALHO, G. 2009. Extração e análises cromatográficas de um inibidor de tripsina presente em folhas de mamona e sua ação no desenvolvimento da lagarta-do-cartucho do milho. Lavras: UFLA,2009. Dissertação (Mestrado em Agroquímica), Universidade Federal de Lavras, 2009.
MOSOLOV, V. V. ; VALUEVA, T. A. 2008. Proteinase inhibitors in plant biotechnology: A review. AppliedBiochemistry and Microbiology, . 44: 233-240.
ONG, E. S. 2004. Extraction methods and chemical standardization ofbotanicals and herbal preparations.Journal of Chromatography BAnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences, 812: 23-33.
RAMOS, V. O. 2012. Isolamento de inibidores de tripsina de sementes de mamona e sua ação sobre o desenvolvimento de Spodoptera frugiperda (Smith,1797) (Lepidoptera: Noctuidae). Lavras : UFLA, 2012. Dissertação (Mestrado em Agroquímica), Universidade Federal de Lavras, 2012.
ROSSI, G. D. et al. 2010. Coffee leaf miner trypsin inhibition with castor beanleaf extracts mediated by a non-protein agent. Ciencia E Agrotecnologia, 34: 361-366.
TEÓFILO, R. F. E.; FERREIRA, M. M. C. 2006. Quimiometriaii: planilhas eletrônicas para cálculos de planejamentos experimentais, um tutorial. Quimica Nova, 29:338-350.
