52º CBQ - Isocromofilona VI isolada de Penicillium sclerotiorum: um fungo endofítico de Duguetia stelechantha (Annonaceae).

ÁREA: Produtos Naturais

TÍTULO: Isocromofilona VI isolada de Penicillium sclerotiorum: um fungo endofítico de Duguetia stelechantha (Annonaceae).

AUTORES: Souza, M.P. (UFAM) ; Nobre, T.A. (UFAM) ; Almeida, F.G.O. (UFAM) ; Souza, A.Q.L. (UEA) ; Forim, M.R. (UFSCAR) ; Souza, A.D.L. (UFAM)

RESUMO: Fungos endofíticos constituem uma fonte promissora de produtos naturais potencialmente bioativos (SCHULZ et al. 2006). Pode-se inferir que plantas contenham microrganismos que mimetizem a química do hospedeiro produzindo o mesmo metabólito bioativo (STROBEL et al. 2003). Existem vários relatos sobre a química de plantas do gênero Duguetia (Anonnaceae) destacando-se a presença de alcalóides e acetogeninas (LEBOUF et al. 1982). Porém, não há informações quanto aos microrganismos endofíticos de plantas deste gênero. Neste trabalho foi caracterizada a isocromofilona VI isolada do fungo endofítico Penicillium sclerotiorum de Duguetia stelechantha. Esse metabólito foi purificado por cromatografia líquida e identificado por espectroscopia de RMN de 1H e de 13C 1D e 2D.

PALAVRAS CHAVES: Duguetia stelechantha; Penicillium sclerotiorum ; Penicillium sclerotiorum

INTRODUÇÃO: Fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior dos tecidos sadios de espécies vegetais sem causar danos aparentes (TAN & ZOU, 2001). A importância desses microrganismos está evidenciada nos estudos que avaliam a produção de metabólitos secundários de diversas classes químicas e atividades biológicas (HAWKSWORTH, 2004) especialmente após a descoberta de fungos que podem produzir substâncias semelhantes às das suas hospedeiras (ZHANG et al., 1997; STROBEL et al., 2004). A hospedeira pertence ao gênero Duguetia (Annonaceae) que apesar de muitos relatos na literatura quanto a composição química de espécies do gênero apresenta um grande vazio sobre a microbiota. Entre a variedade de substâncias que os microorganismos podem produzir está a isocromofilona VI, um corante pertencente a classe de azafilonas, produzida por Penicillium multicolor (ARAY, et al 1995). Neste trabalho, será apresentada a caracterização da isocromofilona VI, isolado do fungo endofítico DgCr3 2.2 (Penicillium sclerotiorum). A sua identificação foi feita através de análises espectroscópicas e espectrométricas. Estudos dos metabólitos de microorganismos endofíticos justificam-se pela sua importância em diversos setores, especialmente na área farmacêutica.

MATERIAL E MÉTODOS: As partes coletadas da planta Duguetia stelechantha (folha, caule, inflorescência, raiz e haste) foram submetidas a um processo de desinfecção, o qual consistiu em uma lavagem com detergente líquido e água corrente. Seguiu-se, em câmara asséptica, a esterilização superficial com álcool 70%, tratamento com hipoclorito de sódio 3% por 4 minutos, nova imersão em álcool 70% por 30 segundos e finalmente a lavagem em água destilada e autoclavada. O material vegetal foi cortado e os fragmentos, colocados em placas de petri contendo três meios de cultura (BDA, Ext. lev. 0,2%, aveia e ISP2). Da água de lavagem 50 µL foram espalhados separadamente nos mesmos meios, para o controle da assepsia. A partir do terceiro dia os fungos endofíticos foram isolados e preservados pela metodologia de Castellani, em água com glicerol 15% e em óleo mineral. Entre os fungos isolados, a linhagem DgCr 3 2.2 foi selecionada para o cultivo em larga escala, após resultado contra a bactéria gram positiva Bacillus cereus. O fungo foi inoculado e incubado por 21 dias a 26-28 ºC em 60 erlenmeyers de 1 L contendo 300 mL do meio BD. O micélio meio foi separado do fermentado por filtração, triturado e macerado com etanol 100% e três vezes com a mistura de acetato/metanol na proporção de 1:1 fornecendo dois extratos. O extrato em etanol 100% foi fracionado sucessivamente em gel de sílica fase normal fornecendo a fração DgP3 a qual foi purificada em CLAE semi- preparativo a fração fornecendo a amostra DgP3-2. Esta amostra foi submetida a espectrometria de massas e espectroscopia de RMN 1H, 13C, 1D e2D em clorofórmio- d.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: No espectro de RMN de 1H foram registrados 14 sinais de hidrogênio, entre os quais 5 correspondem a metilas, sendo uma coerente com metila acílica de um grupo éster. Um multipleto em δ 1,30-1,49 conectado ao carbono em δ 30,0 (HSQC) tem correlação com carbonos em δ 12,0, δ 20,3, δ 35,1 e δ 148,5. Na região de olefínicos, dois hidrogênios em δ 6,17 e 6,95 (dd, J = 15,0 Hz) estão em posição trans. O sinal em δ 5,72 foi registrado como um dubleto e correlaciona com o hidrogênio em δ 2,52-2,45 e com os hidrogênios metílicos em δ 1,86, o qual esta metila esta conectada ao carbono vicinal deste hidrogênio. Um singleto registrado em δ 7,84 conectado ao carbono δ 142,1 que segundo o mapa de HMBC correlaciona com os carbonos δ 144,5; 148,5 e 194,0. O hidrogênio em δ 7, 03, registrado como singleto tem conectação ao carbono δ 111,8 e correlaciona com os carbonos δ 101,9; 114,7; 148,5 e 194,0. Uma metila em δ 1,55 conectada ao carbono δ 23,2 correlaciona com os carbonos em δ 85,0; 184,2; 194,0. O carbono em δ 85,0 apresenta deslocamento químico característico de ligação com oxigênio de éster. O carbono carbonílico em δ 170,1, está ligado a metila em δ 2,17. Dois multipletos em δ 4,10-3,99 e 3,98-3,85 correspondem aos hidrogênios metilênicos do grupo CH2CH2OH ligado ao nitrogênio. Os dados de RMN de 1H e 13C comparados aos dados da literatura e levou a conclusão de que DgP14-2 contém a isocromofilona VI (ARAY, et al 1995). A molécula contém um átomo de cloro na posição C-5 e uma cadeia lateral 5,6-dimetil-1,3-heptadieno no C-3, adicionalmente contem um anel γ-lactâmico. Esta substância pertence a uma subclasse de corantes isolados de algumas espécies do gênero Penicillium, denominadas isocromofilonas que compõe a classe das azafilonas.

Isocromofilona VI

CONCLUSÕES: O estudo químico do fungo endofítico Dg C32.2 identificado como Penicillium sclerotiorum, obtido de Duguetia stelechantha, levou a identificação do corante DgP14-2 como sendo a isocromofilona VI, uma azafilona com fórmula molecular C23H28ClNO5, isolado anteriormente do Penicillium multicolor. Esta nova classe de azafilonas foi reportada na literatura pela atividade em ensaios enzimáticos contra a Acil-CoA (Colesterol aciltransferase) sendo promissores para o tratamento de arterosclerose e hipercolesterolemia (ARAY et al, 1995).

AGRADECIMENTOS: A FAPEAM, a CAPES e ao CNPQ, pelo apoio financeiro aos trabalhos realizados e aqui apresentados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ARAY, N.; SHIOMI, K.; TOMODA, H.; TABATA, N.; YANG, D. J. MASUMA, R.; KAWAKUBO, T.; OMURA, S. 1995. Isochromophilones III~VI, Inhibitors of Acyl-CoA : Cholesterol Acyltransferase Produced by Penicillium multicolor FO-3216. The Journal of antibiotics. 48(7):696-702.
STROBEL, G.; DAISY, B.; CASTILLO, U.; HARPER, J. Natural products from endophytic microorganisms. J. Nat. Prod., 2004.
SCHULZ, B., BOYLE, C., DRAEGER, S., ROMMERT, A.K., KROHN, K. 2002. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycology Research. 106: 996-1004.
LEBOEUF, M.; CAVÉ, A.; BHAUMIK, P.K.; MUKHERJEE, B.; MUKHERJEE, R. 1982. The Phytochemistry of the Annonaceae. Phytochemistry, 21: 2783-2813.
HAWKSWORTH, D.L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections. Studies in Mycology 2004, 50: 9-18.
TAN, R.X.; ZOU, W.X. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat. Prod.
ZHANG, W.; WENDEL, J. F.; & CLARK, L. G. Bamboozled again! Inadverted isolation of fungal rDNA sequences from bamboos (Poaceae: Bambusoideae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 8(2): 205-217, 1997.