Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: Isolamento e caracterização química de 5R-vinil-1,3-oxazolidina-2-tiona (5-VOT), um metabólito derivado do glicosinolato existente no crambe.
AUTORES: Bezerra, P. (UNIFOR) ; Duarte, A. (UECE) ; Rodrigues, T. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL) ; Brito, E. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL) ; Canuto, K. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL) ; Ribeiro, P. (EMBRAPA TABULEIROS COSTEIROS)
RESUMO: O crambe (Brassicaceae) é uma oleaginosa promissora para produção de biodiesel,
devido aos seus altos rendimentos de óleo e de ácido erúcico. Contudo, o seu
farelo contém níveis significativos de glicosinolatos (substâncias tóxicas),
principalmente epi-progoitrina (EPG). Como EPG sofre hidrólise pela mirosinase
endógena, os métodos analíticos de detecção desta substância são feitos por
medidas indiretas de um de seus metabólitos: 5R-vinil-1,3-oxazolidina-2-tiona
(5-VOT). Neste trabalho, as sementes foram submetidas à hidrólise e extração com
tampão Tris-HCl, seguida de separação por CLAE, resultando no isolamento de 5-
VOT (R= 0,2% e P= 95%), que foi caracterizado por EM e RMN. Assim, o 5-VOT
poderá ser usado como padrão no controle de processos industriais/melhoramento
genético do crambe.
PALAVRAS CHAVES: Crambe abyssinica; glicosinolatos; 5R-vinil-1,3-oxazolidina-
INTRODUÇÃO: O crambe (Crambe abyssinica- Brassicaceae) é uma espécie nativa do Mediterrâneo,
mas cultivada no sul do Brasil desde a década de 70. Em virtude de suas sementes
exibirem altos rendimentos de óleo (35%) e teor de ácido erúcico (55%), o crambe
é uma planta de grande interesse industrial, sendo estudada e considerada como
uma cultura promissora para produção de biodiesel. Tal como outras oleaginosas,
a sustentabilidade da cadeia produtiva desta cultura requer o aproveitamento dos
seus resíduos agroindustriais. Entretanto, o farelo desengordurado, que poderia
ser empregado como ração animal por ser rico em proteínas e fibras, contém
teores significativos de glicosinolatos (4%), principalmente epi-progoitrina
(EPG), que são substâncias potencialmente tóxicas (DAUBOS et al, 1998; LEONI et
al., 2003). Em razão disso, tem se buscado estratégias para eliminação/redução
dos níveis de glicosinolatos através de processos industriais ou melhoramento
genético. Como a EPG pode sofrer hidrólise pela enzima endógena mirosinase (Fig.
1), os métodos analíticos de detecção desta substância são feitos por medidas
indiretas obtidas a partir dos níveis de seus metabólitos, entre os quais o 5R-
vinil-1,3-oxazolidina-2-tiona (5-VOT) (LEONI et al., 2003). Neste sentido, a
Embrapa vem conduzindo um projeto em rede que visa ao desenvolvimento de
metodologias modernas e eficientes para quantificação de EPG, a fim de se
identificar rapidamente cultivares isentas ou com baixos níveis de
glicosinolatos. O presente trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar
quimicamente o 5-VOT de uma variedade brasileira de crambe, visando à sua
aplicação como padrão analítico nos métodos cromatográficos a serem
desenvolvidos e validados.
MATERIAL E MÉTODOS: Sementes de crambe (variedade FMS Brilhante), oriundas do Banco de Germoplasma de Crambe da Fundação MS
(Maracaju-MS), foram trituradas, submetidas à extração enzimática através da
mirosinase endógena e posteriormente à separação cromatográfica, segundo o
método otimizado descrito por Leoni e colaboradores (2003). Brevemente, 10g de
sementes foram imersas em 250 mL de solução Tris-HCl 100 mM (pH 8,5), durante 30
min a 37°C. Em seguida, o material foi filtrado a vácuo, sendo adicionado etanol
à solução aquosa até se atingir uma concentração de 70%, a fim de se induzir a
precipitação de proteínas. A solução hidroalcoólica foi centrifugada a 12000 rpm
por 20 min (T=5°C). O líquido sobrenadante foi rotaevaporado e liofilizado,
resultando em 4,3 g de extrato, o qual foi analisado por CLAE. O isolamento do
5-VOT foi realizado em um cromatógrafo preparativo (Waters), em coluna C18
Sunfire (19cmx10mm,5µm), fluxo de 17mL/min, utilizando-se uma fase móvel
isocrática CH3CN/H2O (15:85). A determinação do grau de pureza foi obtida
através de um cromatógrafo Shimadzu, munido de coluna analítica Shim-pack CLC-
ODS (15cmx4,6mm,5µm), detector de arranjo de diodo, empregando-se a mesma fase
móvel da condição preparativa. Os espectros de RMN 1H e 13C, 1D e 2D, foram
obtidos em um espectrômetro DD2-Agilent de 600 MHz, através de uma sonda de
detecção direta de 5 mm, utilizando-se clorofórmio deuterado. O espectro de
massas foram obtidos por infusão direta em um sistema de analisadores de massas
tandem quadrupolo-tempo de vôo, uitilizando-se uma sonda de ionização por
electrospray operando no modo positivo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Hidrólise e extração com tampão Tris-HCl das sementes de crambe seguida de separação cromatográfica por CLAE resultaram no isolamento de 20 mg (rendimento= 0,2%) de um sólido amarelo (1), o qual foi caracterizado como sendo a oxazoliditiona 5-VOT (pureza= 95 %) após análises espectrométricas. O espectro de massas do composto 1 apresentou um pico com m/z 130,0370, compatível com a fórmula molecular [C5H7NOS+H]+. O espectro de RMN 1H do composto 1 apresentou sinais em δ 3,53 (H-4a), 3,92 (H-4b) e 5,33 (H-5), correspondentes a hidrogênios ligados a carbono oxigenado/nitrogenado, sinais em δ 5,40 (H-7a), 5,47 (H-7b) e 5,96 (H-6), referentes a hidrogênios vinílicos e um simpleto em δ 7,97 (3-NH), atribuído ao hidrogênio do grupo amino. O espectro de RMN 13C exibiu 5 linhas espectrais, das quais uma em δ 189,6 (C-2) foi associada a tiocarbonila. Os sinais em δ 132,9 (C-6) e 120,6 (C-7) foram relacionados com carbonos olefínicos, enquanto que os sinais em δ 83,4 (C-5) e 49,1 (C-4) foram caracterizados como carbonos oxigenado/nitrogenado (Tab. 1). O espectro de RMN bidimensional HSQC permitiu correlacionar cada hidrogênio ao seu respectivo carbono. Todos os dados espectrais estavam em concordância com os descritos na literatura (LEONI et al., 1999). No crambe, o 5-VOT é produzido exclusivamente na forma R, enquanto que na colza (Brassica napus), oleaginosa pertencente à mesma família Brassicaceae, são encontrados os dois enantiômeros.
Hidrólise da EPI-progoitrina via mirosinase.
CONCLUSÕES: A obtenção de 5-VOT por hidrólise e extração com tampão Tris-HCl seguida de
isolamento por CLAE mostrou-se um método eficiente e prático de se produzir este
composto na forma enantiomericamente pura, o qual é um produto de alto custo e
pouco acessível comercialmente. Desta forma, será possível darmos continuidade ao
projeto que visa ao desenvolvimento de metodologias cromatográficas para
determinação indireta de glicosinolatos em programas de melhoramento genético do
crambe.
AGRADECIMENTOS: À Fundação MS pela doação das sementes de crambe e à Embrapa pelo apoio financeiro ao projeto “Fastchrom”-SEG 03.12.01.011.0000.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: DAUBOS, P.; GRUMEL, V.; IORI, R.; LEONI, O.; PALMIERI, S.; ROLLIN, P. Crambe abyssinica meal as starting material for the production of enantiomerically pure fine chemicals. Industrial Crops and Products, v. 7, p. 187-193, 1998.
LEONI, O.; BERNARDI, R.; GUEYRARD, D.; ROLLIN, P.; PALMIERI, S. Chemo-enzymatic preparation from renewable resources of enantiopure 1,3-oxazolidine-2-thiones. Tetrahedron: Asymmetry 10, 4775–4780, 1999.
LEONI , O. ; CINTI, S.; ALIANO, N.; TITTONEL, E. D. A rapid chromatographic method for determining the glucosinolate content in crambe seed. Plant Breeding, v. 122, p. 517-520, 2003.