Eficiência do dispositivo Noviplex nas coletas de amostras para análises proteômicas e metaloproteômicas

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Vieira, V. (INSTITUTO DE QUÍMICA (INQUI), UNIVERSIDADE FEDERA) ; Oliveira, G. (INSTITUTO DE QUÍMICA (INQUI), UNIVERSIDADE FEDERA) ; Oliveira, L.C.S. (INSTITUTO DE QUÍMICA (INQUI), UNIVERSIDADE FEDERA) ; Braga, C.P. (UNIVERSITY OF NEBRASKA, LINCOLN, USA) ; Bataglioli, I.C. (INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS- UNESP - BOTUCATU, BRASIL) ; Apostolico, O.A.F. (INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS- UNESP - BOTUCATU, BRASIL) ; Rocha, L.C. (INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS- UNESP - BOTUCATU, BRASIL) ; Buzalaf, M.A.R. (Universidade de São Paulo – USP/Bauru) ; Padilha, P.M. (INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS- UNESP - BOTUCATU, BRASIL)

Resumo

Coletas de amostras biológicas para estudos metaloproteômicos em regiões de difícil acesso enfrentam grandes desafios até que amostras cheguem em laboratórios especializados para realizações das análises. Visando solucionar o problema, adaptamos uma técnica (Cartões Noviplex) usada em coleta de plasma para analises enzimáticas para coletar amostras de tecidos de peixes em campo e usar em análises metaloproteômicas. Noviplex não requer uso de nitrogênio líquido para transporte, é uma tecnologia eficiente e com ótimo custo benefício. Para validar do método, amostras de peixe foram coletadas na região de Porto Velho/Rondônia, usando metodologia tradicional e Noviplex, transportadas ao laboratório, analisados o proteôma e quantificado mercúrio total associado as proteínas encontradas

Palavras chaves

Proteínas; Mercúrio ; Peixes

Introdução

A falta de estrutura e logística durante coletas de amostras biológicas nas regiões afastadas dos grandes centros de pesquisas do Brasil tem causado atrasos nas pesquisas cientificas que visam melhora na qualidade de vida das populações humanas e proteção ao meio ambiente. Coletas de amostras biológicas para estudos metaloproteômicos do mercúrio na região amazônica enfrentam grandes desafios até que amostras cheguem em laboratórios especializados para realizações das análises. Visando solucionar esse problema, esse estudo buscou adaptar e validar uma técnica de coleta de amostras para estudos metaloproteômicos/proteômicos que, além de preservar as amostras biológicas sem necessidade de nenhum tipo de congelamento, tem baixo custo comparado a sua eficácia. O dispositivo de coleta, cartão Noviplex, conta com metodologia simples, facilidade no transporte e conservação das amostras em temperatura ambiente (25°C) por até 6 meses, foi desenvolvido nos Estados Unidos para coleta de sangue usado em análises enzimáticas e está sendo adaptado por nós em coleta de diferentes amostras em campo. Durante o presente estudo, Noviplex mostrou ser uma tecnologia promissora para resolver os problemas de coleta em locais de difícil acesso. Além de todo processo de adaptação da técnica para coleta de campo realizadas durante o presente estudo, o procedimento também contou com validação da metodologia usando coleta tradicional (coletas de amostras com nitrogênio líquido).

Material e métodos

Amostras de tecidos muscular e hepático de 10 exemplares de peixe, piranha preta (Serrasalmus rhombeus) foram coletados na área de abrangência da Usina Hidrelétrica de Jirau em Porto Velho/Rondônia usando metodologia tradicional (coleta com nitrogênio líquido) e cartão Noviplex para comparação de resultados. Para coletas com Noviplex, amostras de tecidos muscular e hepático foram maceradas na presença de tampão específico e percoladas no cartão. Após três minutos, os cartões foram lacrados e transportados para análises. No laboratório, as proteínas percoladas no cartão Noviplex foram extraídas com tampão extrator e fracionadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE). Um controle foi feito com amostras sem uso do cartão Noviplex (Bataglioli et al., 2019). Os géis obtidos com uso do cartão Noviplex e com método tradicional foram analisados e comparados usando software específico para esse fim. Após análises, os spots proteicos foram submetidos a quantificação do mercúrio por GFAAS (Moraes et al., 2013) e aqueles que apresentaram o metal, tiveram suas proteínas caracterizadas por ESI MS MS, com finalidade de entender a estrutura da proteína e associar a ligação do mercúrio a possível sítio de ligação da mesma (Queiroz et al., 2019 e Bataglioli et al., 2019).

Resultado e discussão

Os géis obtidos do tecido muscular, tanto das amostras controles quanto dos cartões Noviplex apresentaram a mesma quantidade de spots (46 spots cada), mostrando que não ocorreram perdas de proteínas quando empregado uso dos cartões. Já no tecido hepático a coleta com cartão mostrou mais eficiente, apresentando 99 spots no gel Noviplex contra 83 spots obtidos pelo método tradicional, resultado esse que demonstra a eficiência das coletas com uso do cartão. Na análise do mercúrio, o controle do musculo apresentou 08 spots associados ao elemento e o cartão 11 spots. No tecido hepático foi identificado mercúrio em 12 spots do controle e 04 do cartão. De modo geral, cada metodologia tem suas particularidades e vantagens, como pode ser observado através dos resultados obtidos no estudo. As coletas com Noviplex mostraram melhor resultado no tecido hepático, possivelmente por conservar melhor as proteínas de baixa massa molecular encontradas nesse tecido e que tem maior afinidade com mercúrio. Quando analisado os dados de identificação do mercúrio, pode ser observado que as coletas com Noviplex, além de possibilitar coleta de amostras proteicas, podem ser usadas para coleta de amostras para analises de metais, viabilizando as análises metaloproteômicas.

Conclusões

Como pode ser observado, as coletas com cartão Noviplex apresentaram resultados promissores, em alguns casos até superiores as coletas de amostras com uso de nitrogênio líquido. As análises de espectrometria de massas resultaram na identificação de metaloproteínas importantes que podem auxiliarem na compreensão de fatores relacionados a exposição ao mercúrio em peixes. Assim, a implantação dessa tecnologia na coleta de amostras biológicas pode trazer grandes avanços em pesquisas realizadas em áreas de difícil acesso como é o caso da região Norte do Brasil, devido a facilidade na coleta e na conservação das amostras durante o transporte e armazenamento.

Agradecimentos

Apoio Financeiro: FAPESP processes n° 2016/19404-2 e CNPq.

Referências

Bataglioli, I. C., Vieira, J. C. S., Queiroz, J. V., Da Silva, M. F., Bittarello, A. C., Braga, C. P., Buzalaf, M. A. R., ADAMEC, J., ZARA, L. F., Padilha, P. M., 2019. Physiological and functional aspects of metal-binding protein associated with mercury in the liver tissue of pirarucu (Arapaima gigas) from the Brazilian Amazon. Chemosphere, v. 236, p. 124320, 2019.

Queiroz, J.V., Vieira, J.C.S., de Oliveira, G., Braga, C.P., da Cunha Bataglioli, I., da Silva, J.M., de Paula Araújo, W.L., de Magalhães Padilha, P., 2019. Identification of Biomarkers of Mercury Contamination in Brachyplatystoma filamentosum of the Madeira River, Brazil, Using Metalloproteomic Strategies. Biological Trace Element Research 187, 291–300.

Moraes, P.M., Santos, F.A., Cavecci, B., Padilha, C.C.F., Vieira, J.C.S., Roldan, P.S., Padilha, P. M., 2013. GFAAS determination of mercury in muscle samples of fish from Amazon, Brazil. Food Chem. 141, 2614 - 267.