Quantificação de Mercúrio em tecido renal de piranha preta (Serrasalmus rhombeus) utilizando estratégias metaloproteômicas

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Assunção, A.S.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA) ; Vieira, J.C.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO DO SUL) ; Martins, R.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA) ; Oliveira, L.C.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO DO SUL) ; Oliveira, G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA) ; Araújo, W.L.P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA) ; Bataglioli, I.C. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA) ; Padilha, P.M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA)

Resumo

Objetivou-se com este trabalho quantificar o teor de mercúrio (Hg) e identificar metaloproteínas em amostras de tecido renal de piranha preta (Serrasalmus rhombeus) utilizando estratégias metaloproteômicas, com o propósito de identificar possíveis proteínas biomarcadores. As estratégias metaloproteômicas utilizadas no presente trabalho foram: eletroforese bidimensional (2D-PAGE), espectrometria de massas com ionização por eletrospray (ESI-MS/MS), espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) e bioinformática. Através da GFAAS, foi possível quantificar o mercúrio nos spots proteicos obtidos no fracionamento das proteínas por 2D-PAGE. Após caracterizações das proteínas por ESI-MS/MS, 9 proteínas foram identificadas como possíveis biomarcadores de Hg.

Palavras chaves

Proteoma; 2D-PAGE; ESI-MS/MS

Introdução

Nos últimos anos, houve interesse crescente na literatura científica em relação as pesquisas associadas com a toxicidade de mercúrio (Hg) na região amazônica, tanto em peixes quanto em seres humanos. Altas concentrações de mercúrio em peixes amazônicos são atribuídas a existência desse metal na agua dos rios e, consequentemente, a bioacumulação ao longo da cadeia alimentar (QUEIROZ et al., 2019). Os efeitos tóxicos que o mercúrio proporciona é devido a habilidade de ligar-se a uma diversidade de biomoléculas que pode afetar sua estrutura e função. Desta forma, estudos com a finalidade de esclarecer os mecanismos pelos quais o mercúrio interage e interfere nos processos bioquímicos do corpo tornam-se relevante (BITTARELLO et al., 2019). Por outro lado, independente da forma química do Hg (Hg2+, Hg0 e MeHg), a exposição ao mercúrio pode ocasionar alterações prejudiciais aos sistemas renal, intestinal, imunológico, cardiovascular e nervoso (SYVERSEN e KAUR, 2012). Pelo exposto, o objetivo deste trabalho foi quantificar o Hg no tecido renal de piranha preta (Serrasalmus rhombeus) utilizando estratégia metaloproteômica.

Material e métodos

Os peixes foram coletados no rio Madeira na região de Porto Velho, localizada no estado brasileiro de Rondônia, Brasil. O tecido renal dos peixes coletados foi macerado em nitrogênio líquido (N2), e as proteínas obtidas foram precipitadas através de misturas etanol/clorofórmio e etanol/ ácido clorídrico. O precipitado foi lavado com etanol gelado e a determinação de proteína total foi realizada método de Biureto, utilizando albumina de soro bovino como padrão. Após esses procedimentos, os pellets proteicos foram ressolubilizados em tampão específico e submetidos ao processo de separação por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D–PAGE, gel de 15%). Os spots proteicos foram recortados dos géis e mineralizados por processo de digestão ácida (sulfúrico/peroxido de hidrogênio 4:1) e o Hg quantificado através de técnica de espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) (MORAES et al., 2013). Os spots que apresentaram Hg, foram levados para caracterização das proteínas por espectrometria de massas com ionização por eletrospray (ESI-MS MS) com objetivo de identificar possíveis biomarcadores proteicos de Hg.

Resultado e discussão

As concentrações de Hg encontrada nos spots ficaram entre 1,205 – 1,308 ppm de Hg. Foi possível quantificar Hg presente em 7 spots (Tabela 1) e caracterizar por ESI-MS/MS 9 proteínas que favorecem a ligação com o Hg. As proteínas caracterizadas como possíveis biomarcadores desse metal em peixes foram: Fructose-bisphosphate aldolase, Aldolase, Peroxisome proliferator- activated receptor beta, Peroxisome proliferator-activated receptor delta- like protein, N-acylneuraminate cytidylyltransferase B, Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, Triosephosphate isomerase, Heat shock cognate 70-1 e Heat shock protein 70. A proteína Triosephosphate isomerase caracterizada no spot proteico não possui íons metálicos coordenados ao seu sítio ativo, entretanto, a presença de metionina na sequência FASTA desta enzima permite a ligação de espécies mercuriais com seus sítios ativos através de interações metal-ligante (BATAGLIOLI et al., 2019). A presença das proteínas de Heat shock cognate 70-1 e Heat shock protein 70 caracterizadas pelo ESI-MS/MS nos spots proteicos pode ser explicada devido essas proteínas serem responsivas a um amplo espectro de metais tóxicos, como o mercúrio. BATAGLIOLI et al. (2019) ao analisarem o proteoma do tecido hepático do pirarucu (Arapaima gigas), espécie de peixe encontrada na Amazônia, identificaram 10 proteínas associadas ao mercúrio como possíveis biomarcadores. A análise de bioinformática realizada pelos autores, utilizando o software Blast2GO, demonstrou que as proteínas ligadas ao mercúrio estavam envolvidas em processos de componentes celulares e processos biológicos.

Concentração de mercúrio (Hg) por GFAAS em spots proteicos de amostras de tecido renal de piranha preta.

Conclusões

As concentrações de Hg realizadas por GFAAS nos spots proteicos ficaram entre 1,205 – 1,308 ppm. Dentre as proteínas identificadas por ESI-MS/MS, 9 favorecem a ligação com o Hg, podendo ser possíveis biomarcadores de Hg para monitoramento deste elemento em peixes.

Agradecimentos

FAPESP processes n° 2016/19404-2 e CNPq.

Referências

BATAGLIOLI, I. C.; VIEIRA, J. C. S.; QUEIROZ, J. V.; FERNANDES, M. S.; BITTARELLO, A. C.; BRAGA, C. P.; BUZALAF, M. A. R.; ADAMEC, J.; ZARA, L. F.; PADILHA, P. M. Physiological and functional aspects of metal-binding protein associated with mercury in the liver tissue of pirarucu (Arapaima gigas) from the Brazilian Amazon. Chemosphere, v. 236, p. 124320, 2019.
BITTARELLO, A. C.; VIEIRA, J. C. S.; BRAGA, C. P.; ARAÚJO, W. L. P; BATAGLIOLI, I. C.; DA SILVA, J. M.; BUZALAF, M. A. R.; FLEURI, L. F.; PADILHA, P. M. Characterization of molecular biomarkers of mercury exposure to muscle tissue of Plagioscion squamosissimus and Colossoma macropomum from the Amazon region. Food Chemistry, v. 276, p. 247–254, 2019.
MORAES, P. M.; SANTOS, F. A.; CAVECCI, B.; PADILHA, C. C. F.; VIEIRA, J. C. S.; ROLDAN, P. S.; PADILHA, P. M. GFAAS determination of mercury in muscle samples of fish from Amazon, Brazil. Food Chemnistry, v. 141, p. 2614-2617, 2013.
QUEIROZ, J. V.; VIEIRA, J. C. S.; OLIVEIRA, G.; BRAGA, C. P.; BATAGLIOLI, I. C.; SILVA, J. M.; ARAÚJO, W. L. P.; PADILHA, P. M. Identification of Biomarkers of Mercury Contamination in Brachyplatystoma filamentosum of the Madeira River, Brazil, Using Metalloproteomic Strategies. Biological Trace Element Research, v. 187, p. 291–300, 2019.
SYVERSEN, T.; KAUR, P. The toxicology of mercury and its compounds. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, v. 26, p. 215-226, 2012.