Mecanismo de inibição enzimática da tirosinase de cogumelo por derivados de 3-(acridin-9-il)-n-benzilideno-2-cianoacrilohidrazidas

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Meira Menezes, T. (UFPE) ; Vitalino de Almeida, S.M. (UPE) ; Olímpio de Moura, R. (UEPB) ; Alves de Lima, M.C. (UFPE) ; Luiz Neves, J. (UFPE)

Resumo

A enzima tirosinase apresenta papel chave no desenvolvimento de câncer de pele, se tornando possível fazer uso de tal enzima como alvo molecular terapêutico. Neste trabalho avaliaram-se derivados de acridinas como inibidores tirosinase. Para este efeito, as spiro- acridinas AMTAC 01 e AMTAC 02 foram sintetizadas e seus mecanismos de inibição enzimática foram investigados. Os resultados da inibição enzimática sugerem que os compostos AMTAC 01 seguem um tipo de inibição não competitiva para a AMTAC 01 e tipo mista para a AMTAC 02. No entanto, a AMTAC 02 (IC₅₀ = 96,29 μM) inibe a enzima mais efetivamente que a AMTAC 01 (IC₅₀ = 189,40 μM), o que indica um papel altamente relevante do grupo metoxila da AMTAC 02 para a atividadade inibitória da tirosinase.

Palavras chaves

tirosinase; acridinas; inibição

Introdução

A enzima tirosinase tem papel biológico no processo de melanogênese, com responsabilidade sobre a pigmentação da pele e de proteção contra raios – UV provenientes do sol. Contudo, alterações na atividade cinética desta enzima possibilitam a formação de desordens de pigmentação, chamados de melasma (SABUDAK, T. et al, 2013). A hiperpigmentação – causada pelo aumento na atividade da tirosinase - é um dos sintomas mais aparentes de câncer de pele, sendo conhecido por melanoma o câncer mais letal (DESAI, S. R., 2014). O mecanismo de atuação da enzima tirosinase na produção de melanina envolve uma reação de oxiredução em presença de oxigênio, com a transferência de elétrons para os íons cobre presente no sítio ativo, gerando a oxidação do substrato tirosina (CHANG, T., 2009). Substâncias dotadas de grupos doadores de elétrons demonstraram alta atividade inibitória da tirosinase (CHO, S. J. et al, 2006; KHATIB, S. et al, 2005; ZHANG, L. et al, 2017), então compreende-se que esta propriedade redutora tenha papel chave na inibição da enzima citada, para que a mesma tenha a capacidade de reagir com o íon cobre no lugar do substrato (COOKSEY, C. J. et al, 1998). Compostos acridínicos participam de uma série de reações como agentes redutores (HEMACHANDRAN, H. et al, 2018; RUZZA, P. et al, 2017; SONG, S. et al, 2017). Além disso, foi indicado em trabalho publicado pertencente ao nosso grupo de pesquisa que a atividade antitumoral em células de melanoma é recorrente em spiro- acridinas (ALMEIDA, S. M. et al, 2016), fazendo assim, do grupo acridina uma classe de compostos com alto potencial para a redução do metal envolvido na ligação O-Cu(II)-O no sítio ativo da tirosinase. Como em artigos anteriormente reportados não se tem conhecimento do mecanismo de ação de compostos acridínicos na inibição do crescimento de células de melanoma, mostra-se necessário o estudo de atividade enzimática e de mecanismos plausíveis que justifiquem a inibição tumoral por parte destes compostos. Com base nisto, foi avaliada a atividade enzimática da tirosinase quando em contato com duas spiro-acridinas (AMTAC 01 e 02) a fim de verificar a viabilidade das acridinas como agente inibitório desta biomolécula.

Material e métodos

Os compostos AMTAC 01 e AMTAC 02 foram sintetizados pela literatura reportada (ALMEIDA, S.M. et al, 2016). O ensaio de inibição da tirosinase foi realizado pelo método de Cho et al. (2006) com modificações. Adicionou-se 100 µL de solução 0,5 mM de substrato L-DOPA em tampão fosfato 0,05 M (pH 6,8) às soluções dos compostos em diferentes concentrações (0,6 mM a 0,008 mM) previamente dissolvidas em DMSO. Para cada poço foi adicionado 10 μL (0,25 mg/mL) da enzima e a inibição foi monitorada pela formação de dopacromo a 475 nm por dez minutos utilizando-se leitor de microplacas ELISA (Bio-rad).Os resultados foram comparados com o ácido kójico e a amostra com DMSO como referência. A porcentagem de inibição da atividade enzimática foi calculada através do gráfico de IC₅₀. O mecanismo de inibição é avaliado pelo efeito do inibidor em K_m (constante de Michaelis-Menten) e V_máx (velocidade de reação máxima).

Resultado e discussão

Para o cálculo da atividade enzimática da tirosinase foram consideradas as taxas médias de inibição (IC₅₀) das spiro-acridinas, com quantificação mais eficiente na AMTAC 02 (IC₅₀ –  96.29 μM) em comparação com a AMTAC 01 (IC₅₀ – 189.40 μM), usando como controle o ácido kójico (IC₅₀ - 17.40 μM). A variação em torno de 51 % de inibição da AMTAC 02 com relação à AMTAC 01 pode ser esclarecida pelo efeito indutivo da metoxila (OCH₃) presente na AMTAC 02, que doa densidade eletrônica para o anel aromático, deslocalizando a carga negativa. Esse acúmulo de elétrons no anel permite uma maior facilidade de interações com os aminoácidos pertencentes ao sítio ativo da enzima. Além disso, há a questão da eletronegatividade do oxigênio que pode favorecer a formação de ligação coordenada da metoxila com o metal cobre da tirosinase. Com o intuito de analisar o mecanismo de inibição dos compostos, foi investigado o comportamento da equação de Lineweaver-burk e sua variação de acordo com a concentração do inibidor (LINEWEAVER, H., BURK, D., 1934). Os resultados demonstram que o tipo de inibição da AMTAC 01 apresenta perfil de inibição não competitiva, tendo em vista que a V_mapp diminui e a K_mapp não se modifica de acordo com a concentração de inibidor. Contudo para a AMTAC 02, V_mapp e a K_mapp aumentam simultâneamente, indicando que a inibição apresenta mecanismo misto (competitivo e acompetitivo), apesar de se aproximar em sua maior parte do mecanismo competitivo devido ao aumento da K_mapp e diminuição da V_mapp com o aumento da concentração de AMTAC 02 no sistema analisado. As constantes de inibição (K_I) evidenciam a alta afinidade da enzima pelos inibidores apresentando ordem de grandeza a nível micromolar (10^-6). A AMTAC 02 se liga mais fortemente à enzima livre (K_I = 19,16 μM) do que a AMTAC 01 (K_I = 179,1 μM). De acordo com o modelo de inibição, K_IS= 476,3 μM foi determinado apenas para o AMTAC 02 devido ao seu comportamento predominantemente competitivo. Recentemente foram relatadas as atividades inibitórias da tirosinase por derivados da benzonitrila, que apresentaram valores de IC₅₀ similares às spiro-acridinas aqui reportadas (NIHEI, K., KUBO, I., 2019). A luteolina, um tipo de flavonóide encontrado em extratos de plantas, apresenta mecanismo de inibição e valor de IC₅₀ equiparado ao perfil de inibição encontrado para a AMTAC 01 (KUBO, I., et al, 2000). Em comparação com os resultados obtidos, relata- se em literatura que o inibidor natural cinamaldeído apresenta IC₅₀ = 980 μM, valor cerca de 10 vezes maior que o IC₅₀ da AMTAC 01 e 5 vezes maior que a AMTAC 02 (KIM, Y., UYAMA, H., 2005).

Conclusões

As spiro-acridinas têm a capacidade de inibir de modo eficaz a tirosinase dos cogumelos (todos os parâmetros de inibição medidos estão na faixa de micromolar). Como notado, a AMTAC 01 difere estruturalmente da AMTAC 02 por um grupo metoxila, ocasionando um tipo diferente de inibição. Portanto, o AMTAC 01 exibiu uma inibição do tipo não competitiva e AMTAC 02 mista, evidenciando a relevância do grupo metoxilo para a inibição da enzima.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro.

Referências

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DESAI, Seemal R. Hyperpigmentation therapy: a review. The Journal of clinical and aesthetic dermatology, v. 7, n. 8, p. 13, 2014.

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KIM, Y.-J.; UYAMA, H. Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future. Cellular and molecular life sciences CMLS, v. 62, n. 15, p. 1707-1723, 2005.

KUBO, Isao et al. Flavonols from Heterotheca inuloides: tyrosinase inhibitory activity and structural criteria. Bioorganic & medicinal chemistry, v. 8, n. 7, p. 1749-1755, 2000.

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NIHEI, Ken-ichi; KUBO, Isao. Benzonitriles as tyrosinase inhibitors with hyperbolic inhibition manner. International journal of biological macromolecules, v. 133, p. 929-932, 2019.

RUZZA, Paolo et al. Hydroxylated biphenyls as tyrosinase inhibitor: A spectrophotometric and electrochemical study. European journal of medicinal chemistry, v. 126, p. 1034-1038, 2017.

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ZHANG, Long et al. Investigating the inhibitory activity and mechanism differences between norartocarpetin and luteolin for tyrosinase: A combinatory kinetic study and computational simulation analysis. Food chemistry, v. 223, p. 40-48, 2017.