Identificação de inibidores da ciclofilina D humana em tratamento para doenças neurodegenerativas

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Pereira, F. (EACH-USP) ; Cruz Araújo, S. (CCNH-UFABC) ; Honório, K.M. (EACH-USP) ; Ferreira-júnior, J.R.S. (EACH-USP)

Resumo

A Ciclofilina D humana (CyDh) é uma isomerase de matriz mitocondrial codificada pelo gene PPIF. CyDh atua na regulação da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial (MPTP), que, quando aberto, libera íons Ca2+ da mitocôndria para o citoplasma. Uma abertura prolongada do MPTP pode ser a principal causa de diversas doenças relacionadas danos e traumas cerebrais; hepatotoxicidade por acetaminofeno; esclerose lateral amiotrófica; e esclerose múltipla. O objetivo deste projeto consiste em realizar ensaios de varredura com pequenas moléculas com potencial inibitório da CyD humana. Aqui são mostrados os primeiros resultados provenientes do processo de validação do método de ensaio virtual (redocking), além da identificação de possíveis novos inibidores da ciclofilina D humana.

Palavras chaves

Docking; Ciclofilina D; Inibidores

Introdução

A Ciclofilina D humana (CyDh) é uma isomerase de matriz mitocondrial codificada pelo gene PPIF, e que atua na regulação da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial (MPTP), que, quando aberto, libera íons Ca2+ da mitocôndria para o citoplasma (Forte e colaboradores, 2007). Uma abertura prolongada do MPTP pode ser a principal causa de diversas doenças relacionadas à disfunção mitocondrial, tais como doenças relacionadas a lesões cardíacas; distrofia muscular causada por deficiência em colágeno VI; danos e traumas cerebrais; hepatotoxicidade por acetaminofeno; esclerose lateral amiotrófica; e esclerose múltipla (Rasola e Bernardi, 2007). Devido ao fato de a abertura do MPTP estar envolvido em nesta diversidade de doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, a CyD surge como um novo alvo terapêutico para todas estas doenças, e a possibilidade de se chegar a um único fármaco capaz de ser utilizado em todos os casos mostra-se de suma importância no que diz respeito aos investimentos voltados para o tratamento destas doenças. O objetivo deste projeto consiste em realizar ensaios de varredura com pequenas moléculas com potencial inibitório da CyD humana. Para encontrar estes possíveis fármacos, foi realizado um estudo de acoplamento molecular (docking) em CyD humana com pequenas moléculas a fim de encontrar candidatos para um futuro ensaio in vivo. A estratégia de inibição do docking consiste em acoplar pequenas moléculas no sítio ativo do receptor, para com isto, selecionar as moléculas melhores ranqueadas para futuros ensaios in vivo (Guido e colaboradores, 2010).

Material e métodos

Primeiramente, foram selecionadas todas as estruturas tridimensionais da hCyD no banco de dados de proteínas PDB (do inglês, Protein Data Bank), o que totalizou 38 estruturas, sendo que, destas, foram selecionadas para análise apenas as que apresentavam ligante/inibidor, totalizando 19 estruturas. Destas, realizou-se o redocking de modo em que o receptor se encontrava totalmente rígido, e, paralelamente, um outro redocking no qual o receptor encontrava-se parcialmente flexível, neste caso, determinando como flexíveis os principais resíduos de aminoácido que participam da interação receptor-ligante, de acordo com os mapas disponíveis no PDB. Tais residuos são: Thr-149, Asn-144, Arg-97, Gln-105, Gln-63, Asn-102, e Thr-107 Após a obtenção das estruturas 3D dos compostos, dentre as inúmeras poses geradas para cada composto, foi escolhida como molde para o alinhamento as três estruturas que apresentavam as principais interações propostas na literatura, além de selecionado o melhor resultado de RMSD. Portanto, realizou-se a etapa de triagem virtual para três estruturas do receptor selecionadas previamente na etapa de redocking (Código PDB: 4J5E, 4J58, e 4J59), utilizando o subconjunto Clean-Leads, que conta com o número total de 4.591.276 moléculas, e que está disponível na base de dados ZINC Portanto, realizou-se a etapa de triagem virtual para três estruturas do receptor selecionadas previamente na etapa de redocking (Código PDB: 4J5E, 4J58, e 4J59), utilizando o subconjunto Clean-Leads, que conta com o número total de 4.591.276 moléculas, e que está disponível na base de dados ZINC.

Resultado e discussão

Após a obtenção das estruturas 3D dos compostos, dentre as inúmeras poses geradas para cada composto, foi escolhida como molde para o alinhamento as três estruturas que apresentavam as principais interações propostas na literatura, além de selecionado o melhor resultado de RMSD (utilizando o programa Chimera 1.6.274) (Tabela 4). Tais estruturas de ligantes foram as de código PDB 4J5E, 4J58, e 4J59, as quais estão representadas com seus respectivos valores de RMSD na Figura 1. É importante ressaltar que no redocking em que o receptor encontrava-se de modo parcialmente flexível houve melhor sobreposição entre o ligante cristalográfico e a estrutura utilizada no redocking, além de apresentar valores mais baixos de RMSD, em relação ao redocking rígido. As 3 estruturas previamente selecionadas foram acopladas em relação ao subconjunto de moléculas “Clean-Leads, que encontra-se disponível na base de dados ZINC. A escolha do subconjunto Clean-Leads deu-se por este possuir algumas características que incluem um peso molecular entre 250 e 350 Daltons; também possui um coeficiente de partição (p.xlogp) <= 3,5; além disso, também possui um número de ligações rotacionáveis (p.rb) <= 7, ou seja, todas estas caraceterísticas atendem a regra de 5 de Lipinski. Portanto, primeiramente realizou-se o docking molecular das 4.591.276 moléculas contra o receptor 4J5E. Em seguida, realizou-se um novo ensaio de docking molecular com as estruturas 4J58 e 4J59, porém, levando-se em conta apenas os ligantes que apresentaram número de ligações de hidrogênio igual ou superior à 4. Esta primeira seleção totalizou 184 ligantes, que em seguida foram submetidos a uma nova etapa de triagem virtual, no entanto, nos receptores 4J58 e 4J59 simultaneamente.

Conclusões

Neste estudo foi mostrado os critérios utilizados para a seleção das estruturas 4J5E, 4J58, e 4J59 da Ciclofilina D humana disponíveis no PDB, que foram utilizadas como receptores no docking, e também a validação do método de docking escolhido para este trabalho através do redocking. Também foi relatado os critérios adotados para seleção do subconjunto de moléculas Clean-Leads que foi utilizado no processo de docking tomando como base a regra de 5 de Lipinski. Além disso, mostrou-se todas as etapas de acoplamento (docking) para a seleção dos ligantes/inibidores melhores ranqueados.

Agradecimentos

Referências

GUIDO, R. V.; ANDRICOPULO, A. D.; OLIVA, G., Planejamento de fármacos, biotecnologia e química medicinal: aplicações em doenças infecciosas. Estudos Avançados (2010), 24 (70), 81-98.

MICHALE, F.; GOLD, B. G.; MARRACCI, G.; CHAUDHARY, P.; BASSO, M.; JOHNSEN, D.; YU, X.; FOLWKES, J.; STEM, K.; BERNARDI, P.; BOURDETTE, D. Cyclophilin D inactivation protects axons in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of multiple sclerosis. PNAS, V. 104, p. 7558 – 7563, 2007.

RASOLA, A., BERNARDI, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis (2007) 12:815–833