Síntese e aplicação de Carbon dot de ácido cítrico como sonda fluorescente para determinação de proteínas catiônicas (protamina).

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Química Inorgânica

Autores

Santos, L.E.R. (UFAL) ; Santos, J.C.C. (UFAL) ; Barbosa, C.D.A.E.S. (UFAL)

Resumo

Os pontos quânticos de carbono (CDs) são nanopartículas luminescente que vem sendo explorados como marcadores fluorescentes de biomoléculas em diferentes sistemas. Nesse sentido, esse trabalho teve por objetivo sintetizar e caracterizar CDs, visando a quantificação de protamina, uma proteína catiônica, a qual é utilizada para neutralizar ação da heparina e na purificação do DNA. Os CDs obtidos exibiram tamanho médio de 4,67 nm e emissão no azul centrada em 445 nm. Além disso, apresentou uma variação da intensidade de fluorescência significativa frente a diferentes concentrações de protamina.

Palavras chaves

sondas fluorescentes; carbon dots; protamina

Introdução

A protamina (PR) é uma proteína policatiônica (5000-10000 Da) composta majoritariamente por arginina (mais de 67%), prolina, serina e valina. Esta proteína é pode ser extraída do esperma de salmão e outras espécies de peixes da família Salmonidae (CASTRO et al., 2016). A PR é frequentemente empregada para reverter o efeito anticoagulante da heparina (HP), um polissacarídeo composto por unidades de ácido urônico e um açúcar aminado (GUAN et al., 2017). A HP é um composto glicosaminoglicano que contém sítios negativos (grupos sulfonato e carboxílico), os quais são responsáveis pela ligação com a protamina formando um complexo 1:1, por meio das interações eletrostáticas (ZHANG et al., 2017). A dose necessária de protamina depende da quantidade de heparina circulante no sangue e do período de tempo transcorrido desde a sua administração. De acordo com Barroso et al. (2002), quando não se saibe a concentração de heparina, aconselha-se a dosagem de 1,0 mL de solução de protamina a 10 mg mL^-1, todavia, estas dosagens dependem do quadro clínico do paciente. Pois, o uso excessivo de PR pode induzir muitos efeitos adversos, incluindo hemorragia e parada cardíaca. Portanto, é de grande importância detectar e quantificar heparina e protamina utilizadas em aplicações médicas. Atualmente, várias estratégias têm sido desenvolvidas para monitorar eficientemente os níveis de protamina em sistemas biológicos, a exemplo da eletroforese capilar, espectroscopia Raman de superfície, métodos eletroquímicos , ensaios colorimétricos e métodos fluorescentes. Estes últimos, vem atraindo atenção devido às vantagens em termos de facilidade de operação, detecção em tempo real, alta sensibilidade e seletividade (GAO et al., 2018). Dentre as sondas fluorescentes, uma nova classe de nanomaterial de carbono, os carbon dots (CDs), que foram descobertos acidentalmente em 2004 durante a separação e purificação de nanotubos de carbono tem se destacado por suas propriedades óticas, eletrônicas, baixo custo, síntese fácil e sustentável, solubilidade em água, biocompatibilidade e baixa toxicidade (PENG et al., 2015). Nesse sentido, o uso de CDs no monitoramento de protamina é de grande relevância, uma vez que são raros os trabalhos que utilizaram somente CDs como sonda para PR, sendo o primeiro trabalho reportado em 2018 por Zhang e col. (2018). Assim, neste trabalho foi utilizado CDs obtidos através da pirólise do ácido cítrico como sonda luminescente no monitoramento de protamina de soluções aquosas sintéticas.

Material e métodos

Reagentes e soluções Os reagentes utilizados na realização dos experimentos são de grau analítico de pureza, dispensando a necessidade de purificação adicional. As soluções foram preparadas com água ultrapura (18,2 MΩ cm^-1, Gehaka Master Syster, Brasil). O ácido cítrico com pureza acima de 97% foi adquirido da Sigma-Aldrich (EUA). Os demais reagentes utilizados apresentaram pureza mínima de 90% ou mais. A soluções tampão fosfato (10 mM, pH 7) foram preparados pela pesagem direta do respectivo sal, dissolução em água, e ajuste do pH com NaOH e HCl 1 M. A solução estoque de sulfato de protamina (200 mg L^-1) foi preparada pela solubilização de 1 mg desse composto e 5 mL de água. Síntese do Carbon dot As sínteses via pirólise foram efetuadas em um reator de teflon revestido por uma câmara de aço inoxidável com capacidade de 25 mL. Foram adicionadas ao reator 5 g de ácido cítrico, em seguida, este foi carboniza em uma mufla a 180°C por 6 h. Posteriormente, o material obtido sob a forma de um liquido marrom de alta viscosidade foi neutralizado com uma solução de NaOH até pH 7. A solução foi centrifugada a 15000 RPM e filtrada em membrana de 0,22 μm. Por fim a solução foi estocada a 4ºC em refrigerador, até análise. Determinação de protamina Para avaliação do método proposto, utilizando carbon dot como sonda bionalitica, foram adicionados volumes variados de protamina de modo que esta variasse sua concentração entre 0,1 e 0,8 mg L^-1. Por fim, adicionava-se tampão fosfato 10 mM até atingir o volume final de 3,0 mL. Após aguardar 20 min, para o sistema atingir o equilíbrio, as amostras eram analisadas no espectrofluorímetro. Os espectros de emissão de fluorescência foram registados no intervalo de 370 a 650 nm (_ex = 350 nm), com slit de excitação e emissão de 2 e 2 nm, respectivamente. Caracterizações Os espectros de absorbância foram analisados utilizando-se de espectrofotômetro UV-vis modelo UV-3600 Plus, empregando solução de 0,1mg mL^-1 em uma cubeta de quartzo de 10 mm de caminho óptico de 190 a 700 nm, utilizando como referência água deionizada. O tamanho dos CDs sintetizados foi estimado pelo Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), empregando Microtrac Zetatrac 150 Particle Counter (séries S3000/S3500). Afim de investigar os grupos funcionais presentes nas nanopartículas de carbono foram registrados espetros de (FTIR), empregando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (Termo Scientific modelo Nicolet e IR1200). Além disso, os espectros de emissão dos CDs sintetizados foram medidos de 290 a 410 nm (Espectrofluorímetro Fluorolog 3-22, HORIBA).

Resultado e discussão

O espalhamento dinâmico de luz é uma técnica de medição da distribuição de tamanho de moléculas e partículas. Esta técnica foi utilizada para caracterização dos CDs, e os resultados dos histogramas constataram que o tamanho médio dos raios hidrodinâmicos dos CDs foram de 4,70 nm (Fig. 1a). As análises de FTIR foram realizadas a fim de investigar a os principais grupos funcionais dos CDs (Fig. 1b). As nanopartículas exibiram uma banda larga e intensa entre 3600-3200 cm^-1, com pico máximo centrado em 3375 cm^-1, o qual pode ser atribuído às bandas de absorção características dos modos de vibração de estiramentos -OH. A banda em 1396 cm^-1 pode ser atribuída às vibrações de estiramentos simétricos do íon carboxilato (-COO-). A banda característica de absorção C-H que se estende a 3070 cm^-1 também foi observada, enquanto as bandas na região de 1700 cm^-1 implicaram na existência de grupos C=O (GONG et al., 2015; ZHOU et al., 2015). Esses resultados, indicando que esses grupos funcionais contendo oxigênio, estão presentes sob a superfície dos CDs, corroborando com a literatura. Os perfis de absorção no UV-vis do CDs sintetizados foram registrados (Fig. 1c) e são concordantes com a literatura (IQBAL et al., 2016). Essas nanopartículas, exibiram bandas de absorção na faixa de 220 – 350 nm, associadas às transições eletrônicas características dos c-dots, as quais são de natureza n→π^* (ligação C=O) ou π→π^* (ligações aromáticas C=C) (YANG et al., 2009). Os espectros de emissão do CDs foram adquiridos e observou-se que o máximo de emissão foi de 445 nm quando excitado em 350 nm. Nota-se que a emissão é dependente do comprimento de onda da excitação, ou seja, à medida que se alterou o λ_ex (290-410 nm), notou-se um deslocamento da emissão para o vermelho. Este comportamento é devido aos diferentes fluoróforos presentes na composição do nanomaterial produzido. O sistema contendo o CDs respondeu a variação da concentração de protamina (0 – 0,8 mg L^-1), como observado na Fig. 2. Pôde-se observar que a intensidade de fluorescência (IF) do CDs diminuiu linearmente com o aumento da concentração de protamina obedecendo a equação IF = 1,38397 ± (0,003)CPR + 0,1963 ± (0,006) (r = 0,9991), a qual pode ser utilizada para quantificação desta proteína. Esse processo de supressão da luminescência pode estar associado as interações eletrostáticas entre os CDs, os quais possuem em sua superfície grupos carboxílicos (-COO^-), confirmados previamente pelo FTIR, e a protamina, uma proteína catiônica. Quando essa macromolécula e o CDs encontra-se no mesmo sistema, a interação de cargas que ocorre nesse processo leva a agregação do nanomaterial, e consequentemente a supressão da emissão de fluorescência (quenching).

Histograma de DLS do CDs (A), Espectro de FTIR de CDs (B) e espectros de absorção de UV- vis de CDs.


Espectro de emissão de fluorescência de CDs em diferentes concentrações de protamina (0 – 0,8 mg L[sup]-1[/sup]).

Conclusões

Neste estudo, foi desenvolvida uma estratégia simples para síntese de CDs, utilizando ácido cítrico como material precursor. Esses nanomateriais foram caracterizados por DLS, UV-vis, FT-IR e fluorescência molecular. As nanopartículas exibiram um tamanho médio inferior a 10 nm e uma luminescência no azul sob irradiação UV. Adicionalmente, as emissões dos CDs foram dependentes do comprimento de onda de excitação, obtendo-se _em = 450 nm quando excitado em 350 nm. Por fim, foi possível avaliar o potencial do CDs como um biosonda fluorescente, sensível e de baixo custo de protamina (para uma faixa de concentração de (0 – 0,8 mg L^-1) da PR).

Agradecimentos

UFAL, IQB, GCAR, LINQA, CAPES, CNPq e FAPEAL

Referências

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