PROPOSTA DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETECÇÃO DE FIPRONIL POR MEIO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

ISBN 978-85-85905-25-5

Área

Química Analítica

Autores

Souza Pagan, F. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO) ; Carneiro Ferreira, D. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO) ; Fernandes Maciel, U. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO)

Resumo

Inúmeras metodologias analíticas são constantemente avaliadas como alternativas na química analítica, buscando desde limites de quantificação mais refinados até mesmo processos que sejam mais rápidos ou economicamente viáveis. Nessa linha, buscou-se nesse trabalho validar uma metodologia analítica para detecção e quantificação do fipronil® por meio da cromatografia gasosa de alta eficiência (HPLC) com detector ultravioleta. Analisou-se parâmetros como a linearidade, obtendo r = 0,9999 e a equação correspondente por meio da regressão linear em mínimos quadrados. Os limites de detecção e quantificação determinados foram 0,128 e 0,426 mg.L-1, respectivamente. A repetitividade e reprodutibilidade, também foram verificados, corroborando assim com a validação do método analítico proposto.

Palavras chaves

melhoria contínua ; HPLC; validação analítica

Introdução

Na química analítica, pesquisas em metodologia analítica que sejam reprodutíveis, confiáveis e inovadoras são buscadas constantemente pelos pesquisadores (CHELLINI et al., 2015). Para que uma metodologia analítica de identificação ou mesmo quantificação seja difundida como parâmetro de determinação para qualidade e certeza de resultados ela deve passar por um sistema de testes e verificações denominado validação (SWARTZ& IRA, 2018). A validação das metodologias propostas são submetidas ao crivo de órgãos ou agências responsáveis elaboram diretrizes que devem seguidas pelos laboratórios e analistas quando na execução de metodologias próprias de uso analítico (COELHO et al., 2018). Tais diretrizes, previamente estudadas e exaustivamente verificadas, quando adotadas pelos laboratórios fornecem aos órgãos a garantia de que os dados por eles produzidos são corroborados pelas próprias técnicas propostas e que carregam a confiabilidade da certificação estabelecida (NOVAES et al., 2017). Os processos de validação se subdividem em duas classes principais uma determinada de validação no laboratório, que consistem em técnicas de apuração da metodologia levando-se em consideração os inúmeros dados coletados no mesmo laboratório, com mesmo equipamento, analistas e condições repetidas do meio (CANDIOTI et al., 2014). A segunda classe, chamada validação completa, consiste na verificação do método em diferentes laboratórios que integram uma rede análoga de determinação na qual o método de verificação será o mesmo, mas as condições laboratoriais, analistas e equipamentos serão diferentes (BENEVIDES et al., 2014). A consolidação do método se da quando a validação no laboratório e completa reproduzem resultados consonantes (RIBANI et al., 2004). No Brasil, os órgãos reguladores responsáveis pela validação de metodologias analíticas são a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, mais voltada para o ramo alimentício e farmacêutico, e o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia – INMETRO (INMETRO, 2018). Para a ANVISA a diretriz de validação de métodos analíticos DAE dada pela Resolução da Diretoria Colegiada – RDC n° 166 de 24 de julho de 2017 (ANVISA, 2017). Para o INMETRO a orientação fica a cargo do documento DOQ-CGCRE-008 de 05 de agosto de 2016 atualizado em julho de 2018 (INMETRO, 2018). Pelas disposições vigentes o processo de validação passa por uma série de ensaios que incluem, dentre outros, linearidade, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), seletividade, repetitividade, reprodutibilidade, robustez e outros parâmetros estatísticos de análise descritiva (INMETRO, 2018; ANVISA, 2017). A linearidade busca identificar um comportamento diretamente proporcional entre a variável medida e uma resposta dentro de um intervalo determinado (BARROS et al., 2002). Geralmente desconhecido antes do teste, o comportamento pode ser verificado empiricamente através da obtenção de uma curva analítica onde os dados obtidos são levados à regressão linear resultando em um equacionamento descritivo do comportamento observado (DURAND et al., 2016). A regressão linear é bem posta quando o seu coeficiente de correlação, r, se aproxima do valor unitário. A ANVISA recomenda valores de r superiores a 0,99 enquanto o INMETRO, superiores a 0,90 (ANVISA, 2017; INMETRO, 2018). Outros parâmetros constituem ponto de relevante interesse para análise de linearidade como o desvio-padrão e desvio-padrão residual (DPR)dos dados coletados (NOVAES et al., 2017). O parâmetro LD indica o menor valor de uma variável que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado para os limites de exatidão e precisão exigidos pelo método (SANTOS et al., 2014). Já o parâmetro LQ indica a menor quantificação possível para uma variável dentro de um determinado método avaliado (CASSINI et al., 2013). Em trabalhos de validação de metodologia analítica o LD e LQ são comumente obtidos com base nos parâmetros da curva analítica ou na razão sinal e ruído gerados nos equipamentos eletrônicos (SANTOS, 2018). A HPLC/UV é amplamente utilizada na detecção e determinação de inúmeros composto e ensaios analíticos encontrando forte aplicação para a indústria farmacêutica e de pesticidas que encontram no método a descrição completa das formulações e suas propriedades químicas (OHIRA et al., 2018). Como exemplo de composto estudado pela cromatografia líquida encontra-se o Fipronil. O Fipronil, desenvolvido pela Rhone-Poulenc e comercializado atualmente pela BASF®, é um pesticida da família dos pirazois queapresenta como princípio ativo o fenilpirazol, classe II – muito tóxico, que age por contato ou ingestão. Nos insetos inibe a captação de cloretos nos receptores gabaérgicos e canais glutamato-cloro, estes específicos da classe Insecta evidenciando a seletividade do pesticida (GUPTA & ANADÓN, 2018).

Material e métodos

A análise da concentração do princípio ativo (p.a.) no Fipronil 96,11% (m/m) foi realizada solubilizando-se 62,5 mg do produto em metanol via banho ultrassônico durante dez minutos. Após solubilização o volume foi aferido a 100 mL em balão volumétrico. A solução então foi analisada via HPLC de marca Shimadzu, detector UV operando em comprimento de onda de 254

Resultado e discussão

O parâmetro da linearidade verificado foi avaliado de acordo com a área dos picos, obtida pelo cromatograma referentes ao princípio ativo do Fipronil em função da concentração da solução inicial. Os valores de trabalho são apresentados na Tabela 1. Obteve-se para o coeficiente de determinação, R², o valor de 0,9998, ou seja, 99,98% dos dados de concentração de Fipronil são preditos pelo equacionamento obtido da regressão linear apresentado na Equação 3. f(x)=2,9475.10^6 x+4071,1 Equação 3 , onde: f(x) = área dos picos referentes ao princípio ativo do Fipronil; x = concentração da solução de Fipronil 99,11%, mg.mL-1. Tabela 1- Valores de concentração e área do pico referentes ao Fipronil obtidos do cromatograma. Amostra Concentração do Fipronil (mg.mL-1) Área do pico (UM) 7 0,458 1360023,00 6 0,395 1167043,00 5 0,344 1016954,50 4 0,305 892207,33 3 0,253 751446,33 2 0,196 586391,33 1 0,141 420697,00 A Figura 2 traz o gráfico de linha dos pontos da área dos picos referentes ao princípio ativo do Fipronil em função da concentração da solução inicial juntamente com os dados da regressão linear conforme Resolução N° 166 de 24 de julho de 2017 da ANVISA. Figura 2 – Dispersão de pontos da área dos picos referentes ao princípio ativo do Fipronil em função da concentração da solução testada de Fipronil. Fonte: Autores, 2019. A determinação dos valores de LD e LQ para o princípio ativo de Fipronil originou-se da curva analítica obtida da regressão, apresentando ajuste de 99,98%, e valor de desvio padrão residual, DPR, de 0,3705. Relacionando os valores nas Equações 1 e 2 obteve-se, respectivamente, os valores de detecção de 0,00004% e quantificação de 0,00012% expressando os limites de detecção e quantificação em termos de concentração os valores de 0,128 e 0,426 mg.L-1, respectivamente. A seletividade do método aplicada aos placebos não evidenciou picos na região de absorção do Fipronil pesquisado no tempo avaliado indicado a ausência de interferentes ou impurezas no material. Para os testes de recuperação soluções de diferentes concentrações do princípio ativo, p.a., de Fipronil foram preparadas e testadas em comparação com placebos obtendo as porcentagens de concentração determinada e a recuperação calculada. Os valores são apresentados na Tabela 2. Tabela 2- Valores de concentração determinadas para o princípio ativo, massa de princípio ativo, p.a., e placebo em conjunto com a recuperação obtida. p.a. teórico (%) Massa de p.a. (mg) Massa do placebo (mg) Concentração determinada (%) Recuperação (%) 17,49 18,2 39,6 30,451 100,62 16,05 16,7 45,2 25,860 99,73 15,67 16,3 34,7 30,706 99,96 14,99 15,6 33,1 30,522 99,14 16,05 16,7 43,7 26,797 100,84 16,24 16,9 34,6 31,613 100,23 15,38 16,1 34,8 30,400 100,43 30,56 31,8 19,7 59,528 100,31 30,08 31,3 25,3 53,422 100,51 30,85 32,1 22,0 57,255 100,40 30,56 31,8 15,0 65,543 100,36 32,68 34,0 22,3 57,890 99,74 30,47 31,7 22,1 57,077 100,79 32,68 34,1 22,1 58,348 100,17 45,27 47,1 6,7 83,513 99,25 47,19 49,1 6,8 84,620 100,24 48,82 50,8 8,2 82,807 100,07 43,44 45,2 7,3 83,169 100,51 44,21 46,0 7,6 82,789 100,37 44,40 46,2 7,1 83,004 99,64 44,79 46,6 7,1 83,659 100,31 A repetitividade, que engloba a precisão intercorridas experimentais foi determinada para as soluções preparadas e medidas pelo mesmo analista. O valor do CV calculado foi de 0,237%, estando abaixo do limite de 5% estipulado pela Resolução N° 166 da ANVISA vigente. Os valores do teste de Grubbs, G1 e Gn, foram respectivamente 1,809 e 1,284, indicando a concentração da distribuição estatística do teste e sua adequação aos dados bem como indicando a ausência de valores dispersos que fragilizam o modelo de regressão conforme apresentado no trabalho de Monteiro et al., 2018. Uma vez que se mostram inferiores aos valores tabelados no teste para 14 medições. A Tabela 3 traz os valores de concentração definidos na repetitividade, bem como os parâmetros estatísticos descritivos dos valores. Tabela 3- Valores de massa, concentração de Fipronil determinada em duplicata e parâmetros estatísticos para a repetitividade e precisão inter-corridas. Amostra Massa (mg) Concentração de Fipronil (%) Parâmetros estatísticos 01 58,9 44,897 Média = 44,856% Desvio-padrão = 0,106% Teste de Grubbs G1= 1,809 Gn= 1,284 Incerteza ± 0,098% DPR = 0,237% 44,852 02 60,1 44,670 44,664 03 61,1 44,737 44,757 04 61,8 44,993 44,865 05 65,3 44,957 44,936 06 66,4 44,903 44,920 07 69,6 44,929 44,910 A determinação da reprodutibilidade considera as medições realizadas com os erros sistemáticos, nesse caso verificados por medições conduzidas por analistas distintos e com metodologia análoga aquela descrita para a seletividade. Dessa forma cada uma das sete amostras preparadas foram medidas em duplicata por dois analistas distintos, perfazendo 28 dados amostrados, 14 de cada analista. Dos valores medidos no teste de precisão intermediária a média da concentração de Fipronil e desvio-padrão foram respectivamente 44,761% e 0,174% que conduziram para um Teste de Grubbs com G1 de 1,861 e Gn de 1,602, como os valores mostraram-se menores do que aquele tabelado para o teste de 28 medições, G = 2,876, não se observou valores dispersos ou extremos, indicando a boa adequação do modelo aos dados não apresentando variabilidade aleatória e tendenciosa dos dados. O valor de CV para os dados resultou em 0,388%, evidenciando a homogeneidade das variâncias obtidas e a boa precisão intermediária conforme explica JÚNIOR et al., 2018. A estabilidade do método analítico testado, avaliado em termos do início e fim do estudo apresentou para as medições realizadas um desvio-padrão dos dados de 0,504% e DPR de 0,509%. No estudo de Bazilio et al., 2012 os valores mínimos de aceitabilidade do desvio-padrão e DPR em um modelo otimizado de validação se encontram acima daqueles obtidos no presente trabalho corroborando para a boa estabilidade verificada na metodologia. Considerando a robustez do método avaliada para as variações de temperatura do forno em ±5°C as medições conduzidas das sete soluções anteriormente preparadas para o teste de repetitividade são apresentadas na Tabela 4 juntamente com os parâmetros estatísticos. Tabela 4- Valores de concentração do Fipronil em diferentes temperaturas e parâmetro estatísticos para verificação da robustez do método analítico. Amostra Concentração em 20°C (%) Concentração em 25°C (%) Concentração em 30°C (%) Parâmetros estatísticos 1 44,902 44,897 44,516 Média = 44,805% Desvio-padrão = 0,172% DPR = 0,110% 2 44,703 44,670 44,369 3 44,841 44,737 44,515 4 44,998 44,993 44,788 5 44,978 44,957 44,731 6 44,966 44,903 44,715 7 44,956 44,910 44,865 Os valores observados para a robustez do método apresentaram um valor médio de 44,805% com desvio-padrão de 0,172% e DPR de 0,110%. Os parâmetros confirmam a boa estabilidade e previsibilidade dos valores que incrementam a robustez da metodologia avaliada apresentando os valores analisados para o desempenho da robustez do método correntes para aqueles limites apresentados pelo INMETRO conforme DOQ-CGCRE-008 revisada em 2016.

Conclusões

O intervalo de 0,141 a 0,458 mg.(mL)-1 de concentração do Fipronil avaliado mostrou-se linear e consonante com o indicado pelos órgãos reguladores de validação metodológica, INMETRO e ANVISA, para os coeficientes de determinação e correlação, respectivamente 0,9998 e 0,9999, bem ajustados. Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) conduzidos em valores relativos e convertidos na concentração apresentaram os valores de 0,128 e 0,426 mg.L-1, respectivamente com uma imprecisão de ± 0,098%. A recuperação do princípio ativo do Fipronil determinada no trabalho foi consonante aquela observada nos trabalhos com HPLC/UV. Quanto à precisão do método analítico, avaliada a repetitividade do método esta apresentou como desvio-padrão e DPR os valores de 0,106% e 0,237%, respectivamente, ambos inseridos no limite de aceitabilidade determinado na RDC n° 166 da ANVISA que regulamenta os testes de validação. A precisão intermediária, com valores de 0,174% para o desvio-padrão e 0,388% de DPR, também se mostrou dentro dos parâmetros fixados. Os parâmetros de robustez e estabilidade retornaram para os parâmetros média, desvio-padrão e DPR os valores de 44,80%, 0,172% e 0,110%, respectivamente, valores contidos nos limites da norma de validação e mostraram-se consonantes para com aqueles encontrados na literatura para semelhante metodologias.

Agradecimentos

Referências

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