Seleção de variáveis da Microextração Líquido-Líquido Dispersiva visando melhoria da determinação de hormônios em amostras aquosas

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Grandes quantidades de fármacos são produzidas e consumidas anualmente, como resultado do crescimento populacional e industrial, e inadequada disposição dos resíduos. Tais fenômenos elevam a frequência com que esses micropoluentes são detectados em matrizes aquosas, principalmente em águas residuais. A remoção somente parcial ou mula dessas substâncias durante tratamentos convencionais de água de abastecimento, esgotos urbanos e efluentes industriais aumenta a preocupação, quanto aos efeitos adversos que essas substâncias podem desencadear sobre ecossistemas, assim como riscos à saúde humana (ARISTIZABAL-CIRO et al., 2017). Dentre o grupo de micropoluentes, os hormônios, substâncias responsáveis por ajudar no controle metabólico e imunológico, assim como no desenvolvimento das características reprodutivas são aplicados de forma medicamentosa, principalmente na produção de anticoncepcionais ou presentes de forma indevida, na contaminação de alimentos. Essas substâncias despertam grande interesse terapêutico e ambiental, devido ao aumento do uso e os potenciais riscos gerados de desregulação do sistema endócrino em organismos de diferentes níveis tróficos (DE SÁ SALOMÃO; MARQUES, 2015; KOAL et al., 2012). Pela frequente liberação de hormônios no meio ambiente com a deficiência dos tratamentos convencionais de esgoto, a determinação dessas substâncias em matrizes aquosas é uma preocupação justificada e estudos apontam que esses compostos foram detectados, na faixa de ng L-¹ e µg L-¹ em águas residuais e superficiais (MÁRTA et al., 2018; SABINO et al., 2021; TURAZZI et al., 2019). O aprimoramento das técnicas analíticas, tais como a cromatografia líquida/gasosa por espectrometria de massas, permitiu a identificação desses compostos em concentrações mais baixas, porém a combinação com técnicas de preparo de amostra se faz necessário, para o alcance de faixas de detecção cada vez mais sensíveis (GAGO-FERRERO et al., 2019). Metodologias de enriquecimento e seleção de hormônios em amostras ambientais são comummente aplicadas utilizando a extração em fase sólida (SPE), por ser uma técnica de preparo consolidada e com elevadas taxas de recuperação do analito-alvo, porém esse método apresenta elevado custo e a geração de um resíduo final, pela utilização de cartuchos (GHORBANI et al., 2019; SARAFRAZ-YAZDI; AMIRI, 2010). Como alternativa, métodos visando a miniaturização do processo de preparo de amostras vem sendo aplicados, tais como as microtécnicas de extração, que possibilitam a simplificação de etapas, a redução dos custos de análise e a minimização da exposição do analista com a diminuição do volume de solventes e amostra (PŁOTKA-WASYLKA et al., 2015; WERNER et al., 2018). A micro extração líquido-líquido dispersiva (MELLD) é técnica de extração e concentração de compostos-alvo desenvolvida em 2006 (BERIJANI et al., 2006; REZAEE et al., 2006) e recentemente vem sendo aperfeiçoada no desenvolvimento de metodologias específicas para a determinação de compostos orgânicos-alvo em matrizes aquosas de alta complexidade, como urina, plasma, efluentes e amostras ambientais (AMIN; EBRAHIM; POURSAFA, 2017; ROCHA et al., 2016; RYU et al., 2012; VAGHAR-LAHIJANI et al., 2018; VELA-SORIA et al., 2014). Essa técnica vem se mostrando como uma alternativa em potencial para a extração de compostos orgânicos em esgotos sanitários. O presente estudo teve como objetivo a melhoria da metodologia da MELLD para análise de 3 hormônios (estrona, 17-β estradiol, 17-α etinilestradiol), avaliando as variáveis e as condições mais relevantes para a obtenção da melhor resposta de recuperação dos analitos, por meio de uma abordagem estatística de planejamento experimental.

Analitos: Os padrões analíticos de referência dos hormônios estrona (>99,0% CAS 53-16-7), 17-β estradiol (>99,0% CAS 50-28-2) e 17-α etinilestradiol (>99,0% CAS 57-91-0) e os solventes foram fornecidos pela da Sigma-Aldrich. Amostras: Soluções trabalho com concentração de 10 µg L-1 do mix de hormônios foram preparadas em água ultrapura para os ensaios experimentais. Técnica de MELLD: Foi realizada através da aplicação de volumes definidos da mistura dos solventes de extração e dispersão em uma pequena quantidade de amostra (5-8 mL). Após a formação da dispersão, os analitos foram rapidamente extraídos. A separação do solvente extrator contendo os analitos foi realizada por centrifugação e removida com o auxílio de uma micropipeta. A secagem do extrato foi realizada em fluxo lento de nitrogênio gasoso. A reconstituição foi realizada com 100 µL de Metanol:Água, mesma solução da fase móvel aplicada no método cromatográfico, para posterior injeção no cromatógrafo. Desenho experimental: A avaliação e seleção das variáveis e condições consideradas relevantes para a melhoria da MELLD foram realizadas a partir da construção de duas matrizes de planejamento experimental no software Protimiza Experimental Design (Protimiza, 2019). Primeiramente a matriz Plackett-Burman (PB) foi criada para a triagem de 10 variáveis independentes e relevantes para a melhoria do processo, resultando em 19 ensaios, com triplicata nos pontos centrais. As seguintes variáveis independentes foram incluídas com níveis máximo e mínimo obtidos da revisão bibliográfica na literatura especializada: solvente extrator (SE); solvente dispersivo (SD); volume do solvente extrator (VSE); volume do solvente dispersivo (VSD); volume da amostra (VA); pH; adição de sal (AS); tempo de mistura vórtex (TMV); sonicação (SONIC) e; banho de gelo (BG) (Tabela 1). As condições de centrifugação (4000 rpm, 20°C, 15 min – centrífuga Eppendorf 5810R) e a utilização de tubo de ensaio de vidro no formato cônico foram fixadas e mantidas constantes em todo experimento para realização da extração. A solução utilizada no ensaio na matriz PB foi constituída da mistura das 3 substâncias-alvo (E1, E2 e EE2 ), sendo este na concentração de 10 µg L-1. As respostas de recuperação foram obtidas por meio da comparação das áreas cromatográficas. Análise cromatográfica: Os analitos foram determinados por cromatografia em fase líquida de ultra eficiência acoplado ao espectrômetro de massas tipo in tandem, Xevo TQD®, triplo quadrupolo (UPLC-MS/MS, Waters). Foi utilizada a coluna AQUITY® BEH C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm, a 50 °C, fluxo de 0,4 mL min-1 e as fases móveis A=água e B=metanol (0.01 % NH4OH). O volume de injeção foi de 5 μL e o tempo de corrida 6 min. O detector de massas foi o operado em modo negativo com monitoramento de reações múltiplas(MRM).

Os resultados de recuperação dos analitos nas condições preditas na matriz Plackett-Burman (PB) foram apresentadas na Fig. 1. Pelas respostas obtidas verificou-se melhor recuperação na condição 4 para todos os analitos: Solvente Extrator (SE): Diclorometano; Solvente Dispersivo (SD): Acetonitrila; Volume do Solvente Extrator (VSE): 1000 µL; Volume do Solvente Dispersivo (VSD): 1000 µL; Volume da Amostra (VA): 8 mL; pH: 4; Sem adição de sal (AS); tempo de mistura no vórtex (TMV): 30 segundos; sem sonificação (SONIC) e sem banho de gelo (BG); onde foram encontrados 107,93% de recuperação para EE2, 97,68% de recuperação para o analito E2 e 99,41% para o analito E1. Essas condições suportam de forma satisfatória os níveis de recuperação orientados pelas agências de controle (70 - 120%) (AOAC, 2011; EPA, 1992; INMETRO, 2003). Nota-se que, diante dos critérios experimentais e estatísticos, a única variável relevante para o modelo foi o tempo de mistura no vórtex (TMV), sob efeito positivo, ou seja, o auxílio cinético fornecido, contribuiu para o processo de interação analito-solvente extrator para todos os hormônios estudados. Os diagramas de Pareto ilustram a relevância da variável TMV na recuperação dos analitos, sob a condição de 60s de agitação no vórtex, obtendo-se os efeitos +75,68, +67,54 e +70,25 para EE2, E2 e E1, respectivamente, em um nível de confiança de 90% (Fig. 2). As demais variáveis foram eclipsadas pela forte dominância da variável TMV para a recuperação dos hormônios alvo desse trabalho. Segundo a revisão de Mousavi et al (2018) estudos utilizaram a matriz PB para obtenção de parâmetros críticos de otimização, na abordagem de variáveis auxiliares (agitação magnética, vórtex, sonificação entre outros), buscando aumentar a recuperação dos analitos na aplicação da MELLD. A eficiência de recuperação dos hormônios E1, E2 e EE2 foi determinada também por MELLD no estudo de Sousa et al (2020), porém com uma avaliação univariada dos parâmetros da microtécnica. Nesse trabalho, o vórtex também foi aplicado e as recuperações alcançadas foram 72%, 101% e 99% para E1, E2 e EE2, respectivamente. Dmitrieva et al (2020) realizaram a otimização dos parâmetros da MELLD, pelo desenho experimental de Box-Benken, determinando as variáveis e condições mais relevantes na análise de hormônios em amostras de urina. As recuperações alcançadas foram entre 70 e 95%. É importante ressaltar que a aplicação de desenhos experimentais na avaliação de técnicas de preparo de amostras contribui de forma significativa para a identificação das variáveis mais relevantes aliando o custo-benefício e a confiabilidade estatística, se tornando uma ferramenta promissora, diante das rotinas analíticas nos procedimentos de extração.

Figura 1

Recuperações dos analitos do estudo obtidas experimentalmente nas condições dispostas pela matriz PB (n=3).

Figura 2

Repostas dos diagramas de Pareto dos hormônios E1, E2, EE2 da matriz PB.

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Seleção de variáveis da Microextração Líquido-Líquido Dispersiva visando melhoria da determinação de hormônios em amostras aquosas

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