Autores
Marin, F. (UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER) ; Caballero, T. (UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER) ; Romero, A. (UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER)
Resumo
La tromboembolia venosa (TEV) ocupa un lugar importante dentro de estas
enfermedades mortales. En este trabajo, se reporta el diseño, síntesis y actividad
anticoagulante de una serie de híbridos moleculares tetrahidroquinolina-isoxazol.
La síntesis de estos híbridos se llevó a cabo mediante una reacción catiónica de
Povarov, la cual permitió obtener el núcleo tetrahidroquinolínico. Luego se
procedió a formación del núcleo isoxazol, vía una reacción de cicloadición 1,3-
dipolar. A través de las pruebas PT-HS y APTT se pudo comprobar que el compuesto
3h mostró los mejores resultados de anticoagulación. Además, a través de las
pruebas de inhibición de la enzima FXa se pudo comprobar que tiene un efecto
inhibitorio sobre esta enzima con un IC50 de 13.2±1.6 µM
Palavras chaves
Tetrahidroquinolina; Isoxazol; Anticoagulantes
Introdução
Actualmente, el mayor número de muertes a nivel mundial se debe a todas las
muertes causadas por enfermedades cardiovasculares (ECV), dentro de estas
enfermedades se encuentran la tromboembolia venosa (TEV) que incluye la
trombosis venosa profunda (TVP) y la embolia pulmonar (EP) (SALVADOR ZUBIRÁN AND
HERRERO, 2016) [1]. La tasa de mortalidad del tromboembolismo venoso es muy
alta, en los Estados Unidos de América cada año mueren entre 300.000 y 600.000
personas por esta enfermedad, y en toda Europa los casos mortales de TEV tienen
más muertes que los accidentes de tráfico, el VIH, el cáncer de mama y el cáncer
de próstata juntos (COHEN et al, 2007),(BECKMAN et al, 2010).
El tratamiento de esta enfermedad generalmente se lleva a cabo mediante la
administración de medicamentos anticoagulantes que impiden la progresión del
trombo en el torrente sanguíneo, con el fin de estabilizar al paciente, aliviar
los síntomas y prevenir la recurrencia (JIMÉNEZ et al, 2014). Los fármacos
anticoagulantes generalmente utilizados son las heparinas (ejemplo:
Fondaparinux) y el tratamiento con algún antagonista de la vitamina K. La
alternativa a estos tratamientos son los anticoagulantes de uso oral como
Rivaroxabán y Apixabán, estos anticoagulantes se utilizan como monoterapia y se
basan en la inhibición competitiva del Factor Xa de la cascada de la coagulación
(THOMAS, et al, 2013). Estos fármacos que son capaces de inhibir selectivamente
la enzima Factor Xa de la cascada de la coagulación son actualmente ampliamente
estudiados. Con base en lo anterior, es inaplazable la búsqueda de nuevos
compuestos heterociclos nitrogenados, como es el caso de los derivados
tetrahidroquinolínicos e híbridos del mismo, incluyendo el núcleo del isoxazol,
que tengan potencial actividad anticoagulante y que en especial puedan inhibir
el factor Xa de la cascada de coagulación, convirtiéndolos en excelentes núcleos
de estudio.
Material e métodos
Todas las reacciones fueron monitoreadas mediante cromatografía en capa fina,
algunos productos obtenidos en las diferentes etapas sintéticas fueron tratados
mediante proceso de extracción líquido-líquido; otros fueron purificados
mediante cromatografía de columna y posteriormente cristalizados si sus
características físicas lo permitieron. La elucidación de los compuestos
obtenidos, tanto precursores como finales, se realizó por medio de las
diferentes técnicas espectroscópicas y espectrométricas, tales como infrarrojo
(IR), espectrometría de masas de electroespray con analizador de trampa iónica
(ESI-IT), resonancia magnética nuclear (RMN) mono y experimentos.
Las reacciones implementadas en los pasos sintéticos la reacción de Povarov
catiónica para la formación de las correspondientes N-propargil/butinil
tetrahidroquinolinas, de acuerdo con la metodología descrita por RODRIGUEZ y
colaboradores (2016). Una vez las respectivas tetrahidroquinolinas fueron
debidamente purificadas y caracterizadas, se procedió con la obtención de los
híbridos moleculares de interés, empleando una reacción de cicloadición 1,3-
dipolar, mediada por hipoclorito de sodio utilizando como dipolarófilo, aril-
aldoximas preformadas. Dichos híbridos moleculares fueron obtenidos
eficientemente con buenos rendimientos de reacción, luego de la correspondiente
purificación por cromatografía en columna (GUIZA et al, 2019).
Por otro lado, la actividad anticoagulante fue determinada por dos métodos,
inicialmente determinando los tiempos de trombina (PT-HS) y protrombina (APTT),
usando el test de la compañía Linear Chemicals, S.L. bajo la línea Cromatest®.
Mientras, que los experimentos de inhibición de la enzima factor Xa fueron
llevados a cabo utilizando el kit de la compañía AnaSpec, Inc., bajo la línea
SensoLyte® Rh110 kit ref. AS-72207.
Resultado e discussão
• Síntesis de los compuestos híbridos THQ-isoxazol.
Los primeros compuestos sintetizados para acceder a los híbridos moleculares
tetrahidroquinolina-isoxazol fueron las tetrahidroquinolinas 2a-d. Estas THQ se
obtuvieron mediante una reacción catiónica de Povarov entre las aminas
precursoras 1a-d, formaldehído y N-vinilpirrolidona utilizando acetonitrilo como
disolvente y tricloruro de indio como catalizador (Esquema 1). Esta reacción
ocurre primero con la formación de un producto intermedio catiónico de una
reacción de tipo Manich entre amina, formaldehído y N-vinilpirrolidona seguido
de una ciclación intramolecular de tipo Friedel-Crafts. Aunque este mecanismo es
ampliamente aceptado por muchos autores, aún se están discutiendo algunos
aspectos mecanicistas y se debate la ruta propuesta.
A partir de las THQs sintetizadas, se sintetizó la familia de híbridos
moleculares THQ-isoxazol 3a-p. La síntesis de estos híbridos se realizó mediante
una reacción de cicloadición 1,3-dipolar utilizando dos metodologías diferentes,
para los híbridos 3a-h la reacción se realizó entre las tetrahidroquinolinas 2a-
b y las aldoximas preformadas utilizando hipoclorito de sodio (NaOCl),
trietilamina como base y diclorometano como disolvente. Mientras que para los
híbridos 3i-p la reacción se llevó a cabo usando N-clorosuccinimida (NCS), 1,8-
diazabiciclo (5.4.0) undec-7-eno (DBU) como base y dimetilformamida (DMF) como
solvente. En la síntesis de estos nuevos híbridos moleculares, el grupo alquino
de la tetrahidroquinolina actúa como dipolarófilo y la oxima como precursor del
1,3-dipolo. El dipolo se obtiene in situ y se une con las tetrahidroquinolinas
N-propargiladas 2a-d mediante una cicloadición 1,3-dipolar.
• Ensayos como anticoagulantes.
Luego de la correspondiente purificación y caracterización de todos los
híbridos se procedió con la determinación de su actividad anticoagulante. Para
dicho propósito se llevaron a cabo tres pruebas biológicas, Tiempo de Protombina
de Alta Sensibilidad (PT-HS), Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) y
el ensayo fluorométrico de inhibición del Factor Xa. Estos ensayos pretendían
demostrar la amplia perspectiva biológica de los compuestos sintetizados frente
a una proteína de coagulación y sus parámetros habituales de uso en clínica e
investigación (Tabla 1). Sin embargo, los compuestos 3a-d se destacan y muestran
los mejores resultados en las pruebas de PT-HS y APTT, siendo el compuesto 3c el
mejor de todos los híbridos de tetrahidroquinolina/isoxazol con un tiempo de
coagulación de 22,2 segundos para el caso de PT-HS y 46,2 seg para la prueba
APTT. Estos resultados nos muestran que el compuesto 3c es el más activo tanto
para la ruta extrínseca como para la intrínseca.
• Ensayos de inhibición sobre el Factor Xa de la cascada de la coagulación.
La prueba que se realizó fue una prueba tipo screening con todos los compuestos
sintetizados con el fin de encontrar los mejores híbridos, esta prueba se
realizó a una concentración de 100 µM. Como se puede observar, los resultados
obtenidos para la familia de híbridos moleculares tetrahidroquinolina/isoxazol
son muy conservadores y presentan valores que se encuentran alrededor del valor
de inhibición del vehículo control, sin embargo, podemos observar cómo los
compuestos 3n y 3h, presentan mayores valores de inhibición y sobresalen del
grupo de compuestos analizados. El híbrido molecular
tetrahidroquinolina/isoxazol 3h, fue evaluado en una segunda prueba para
determinar su IC50. Las concentraciones seleccionadas para la determinación del
IC50 fueron 200, 100, 50, 25 y 10 µM.
Los resultados obtenidos para los ensayos de concentración inhibitoria media
para el híbrido tetrahidroquinolina/isoxazol mostraron que el hibrido 3h tiene
un IC50 = 13.2±1.6 µM, lo cual muestra que presenta una inhibición considerable
sobre la enzima FXa.
Síntesis de los nuevos híbridos moleculares tetrahidroquinolina/isoxazol 3a-p.
Híbridos tetrahidroquinolina/isoxazol 3a-p sintetizados y resultados actividad anticoagulante.
Conclusões
Fue posible sintetizar los híbridos moleculares THQ-Isoxazol empleando
metodologías clásicas de reacciones de cicloadición 1,3-dipolar a partir de los
derivados N-propargil/butinil tetrahidroquinolinas 2a-d obtenidas vía reacción de
Povarov catiónica. Además los resultados obtenidos en los bioensayos mostraron que
los híbridos moleculares tetrahidroquinolina/isoxazole mostraron una moderada
actividad anticoagulante e inhibitoria sobre la enzima FXa.
Agradecimentos
Los autores quieren agradecer a la Vicerrectoría de Investigación y extensión de
la Universidad Industrial de Santander por su financiación al proyecto de
investigación código 2818 (2021).
Referências
BECKMAN M.G., HOOPER W.C., CRITCHLEY S.E., AND ORTEL T.L. Venous Thromboembolism. American Journal of Preventive Medicine 38 (4): 495-501, 2010.
COHEN A., GIANCARLO A., FREDERICK A., ARCELUS J., BERGQVIST D., BRECHT J., GREER I., et al. Venous Thromboembolism (VTE) in Europe. Thrombosis and Haemostasis 98 (10): 756–64, 2007.
GÜIZA F.M., DUARTE Y.B., MENDEZ-SANCHEZ S.C., ROMERO BOHORQUEZ A.R. Synthesis and in vitro evaluation of substituted tetrahydroquinoline-isoxazole hybrids as anticancer agents. Medicinal Chemistry Research. 28, 1182–1196, 2019.
JIMÉNEZ, D., D. KOPECNA, J.de M, AND SUEIRO. A.Tromboembolia de Pulmón. Medicine (Spain) 11 (68): 4051–58, 2014.
Rodríguez Y.A., Gutiérrez M., Ramírez D., Alzate-Morales J., Bernal C.C., Güiza F.M., Romero Bohórquez A.R. Novel N-allyl/propargyl tetrahydroquinolines: Synthesis via Three-component Cationic Imino Diels-Alder Reaction, Binding Prediction, and Evaluation as Cholinesterase Inhibitors. Chemical Biological Drug Design. 88(4): 498-510, 2016.
SALVADOR Z. AND HERRERO A.G. Tromboembolia Venosa. In: Manual de Terapéutica Médica y Procedimientos de Urgencias, 7e. New York, NY: McGraw-Hill Education, 2016.
TYAN T., GANETSKY V. AND SPINLER S.A. Rivaroxaban: An Oral Factor Xa Inhibitor. Clinical Therapeutics 35 (1): 4-27, 2013.
