Autores
Pacheco, G. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Núñez, G. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Arrieche, D. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Llovera, L. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Diaz, K. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Olea, A. (UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHILE) ; Taborga, L. (UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA)
Resumo
En este proyecto se llevó a cabo la síntesis y caracterización química de una
nueva serie de derivados de prenilfenoles que inhiben el crecimiento micelar de B.
cinerea. La síntesis se logró a través de la reacción del correspondiente fenol
sustituido, prenol y ZnCl2 como catalizador mediante una reacción de SEA promovida
por irradiación de microondas, obteniendo rendimientos entre (5,4 - 13,3) %. La
caracterización de los derivados sintetizados fue realizada empleando 1D-RMN y 2D-
RMN. El efecto del crecimiento micelar de los derivados sintetizados sobre B.
cinerea, se determinó en un medio de PDA siendo el control positivo BC1000®. Se
obtuvieron valores de EC50 entre (56,89 - 97,38) ± 1,2. Estos resultados indican
que los cuatro compuestos sintetizados inhiben el crecimiento micelar.
Palavras chaves
Prenilfenoles; Antifúngico; Botrytis cinerea.
Introdução
Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno promovido por la presencia de agua
superficial libre o alta humedad relativa que causa importantes pérdidas en los
cultivos de una amplia variedad de especies de plantas (CASTRO et al., 2019).
Las pérdidas se estiman entre 10 mil millones y 100 mil millones de dólares en
todo el mundo tanto en condiciones previas como post cosecha por lo que resulta
muy importante su control en ambas condiciones (VASQUEZ-MONTAÑO et al., 2020).
Por esta razón, el desarrollo de nuevos compuestos antifúngicos es esencial.
Por ejemplo, los compuestos fenólicos, terpenoides que han sido aislados de
plantas tales como el drimenol y derivados sintéticos del nordrimenona han
mostrado actividades antifúngicas (SILVA-MORENO et al., 2017). Los fenoles
prenilados y sus productos ciclados se distribuyen ampliamente en la naturaleza
y corresponden a un interesante grupo de productos marinos y vegetales, con una
amplia variedad de actividades biológicas descritas entre ellas
antiinflamatorias, antifúngicas, anti-VIH, anti-Alzheimer y con mayor
frecuencia, propiedades antieoplásicas (VERGARA et al., 2015). Los fenoles
ortoprenilados desempeñan un papel importante en la mediación de muchos procesos
biológicos y pueden ser sintetizados empleando ortometalación y alquilación,
intercambio y acomplamiento metal-halógeno, reordenamiento de Claisen, reacción
de Friedel-Crafts (MULA et al., 2006). El método más interesante para nosotros
es la Sustitución Electrofílica Aromática (SEA) asistida por microondas. En este
trabajo se presenta la síntesis y caracterización espectroscópica de cuatro
derivados del prenilfenol y su evaluación en la inhibición del crecimiento
micelar de B. cinerea.
Material e métodos
Las síntesis fueron realizadas en un microondas Monowave 200 (Anton Paar). La
separación se realiza mediante cromatografía de columna flash utilizando un
cromatógrafo líquido preparativo Gilson (PLC 2250 UV-1) con detector UV. Para la
caracterización espectroscópica, se empleó un espectrómetro RMN Digital Avance
400 Bruker, operando a un campo magnético de 400,1 MHz para análisis de protón
1H y a 100,6 MHz para 13C. Procedimiento general para la síntesis de
prenilfenoles: En un vial reactor de microondas de 30 mL con una barra de
agitación magnética, se introduce el fenol sustituido (1 mol eq.) y se disuelven
completamente en 10 mL de acetato de etilo. Luego se agrega el prenol (1 mol
eq.), el ZnCl2 (2 mol eq.) y se agita hasta obtener una mezcla homogénea. La
síntesis es asistida por un reactor de microondas. La mezcla de reacción se
expone a una temperatura de 50 °C por 1 h o a 60 °C por 30 min, dependiendo de
la naturaleza del fenol. Al terminar, se realiza una extracción líquido-líquido
con acetato de etilo y agua, se ajusta el pH = 6-7, se separa la fase orgánica,
se seca son sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra. La mezcla
obtenida se separa usando cromatografía de columna flash para obtener el
compuesto de interés y se caracteriza por RMN. Procedimiento general para la
determinación del crecimiento micelar: La actividad biológica contra B. cinerea
de los derivados de prenilfenol se realizó a partir de las medidas del diámetro
del crecimiento del micelio alcanzado a diferentes concentraciones en un medio
PDA por tres días, empleando BC1000® como control y por triplicado. Los valores
de EC50 se obtienen ajustando los datos de crecimiento a una curva de dosis-
respuesta utilizando un software de análisis de datos.
Resultado e discussão
Se llevó a cabo la síntesis de cuatro prenilfenoles mediante irradiación de
microondas a partir de una reacción de sustitución electrofílica aromática (SEA)
entre un fenol sustituido y el prenol, catalizada por ZnCl2, siguiendo una
relación estequiométrica 1:1:2. La reacción se somete a una temperatura de 50°C
por 1 hora, cuando se trabaja con resorcinol y pirocatecol, o a 60°C por 30 min
si el material de partida es orcinol o hidroquinona, obteniendo rendimientos
entre 5.4 - 13%. El mayor rendimiento se obtiene en el acoplamiento de
hidroquinona y pirocatecol (13,3 %), seguido del orcinol prenilado (8,8 %) y
finalmente el de resorcinol (5,4 %). Al purificar por cromatografía de columna
flash se optimizaron las condiciones al emplear una columna de silica gel de 80
g con una presión máxima de 16 bar. La fase móvil: hexano / acetato de etilo al
20 % o 30 % permitió la separación de las mezclas de reacción previamente
disueltas en diclorometano hasta saturar la silica gel y proceder a inyectar en
seco en el equipo. Al emplear el método de separación creado para nuestros
sistemas, el equilibrio del sistema se alcanza a un flujo de 55 mL/min por 5
min. Esta técnica no sólo nos permite obtener en un corto tiempo las fracciones
de interés sino en un alto grado de pureza, resultado que se evidencia en la
adquisición de los espectros de 1H RMN. En cuanto a los análisis biológicos
realizados, todos los compuestos sintetizados presentan actividad contra B.
cinerea, mostrando valores de EC50 de 97,38 ± 1,2 µg/mL (orcinol), 97,03 ± 1,4
µg/mL (hidroquinona), 96,37 ± 1,1 µg/mL (resorcinol) y 56,89 ± 1,2 µg/mL
(pirocatecol) versus el control positivo BC1000® (81,67 ±1,1 µg/mL). Estos
resultados sugieren que el pirocatecol pudiera ser un buen candidato para el
control del moho gris.
Conclusões
El uso de irradiación de microondas en la obtención de los derivados de
prenilfenol mejoró considerablemente los tiempos de reacción y porcentajes de
rendimiento en comparación al método convencional. A través de cromatografia de
columna flash se obtuvieron las fracciones puras de los derivados de interés que
fueron caracterizados químicamente mediante RMN empleando técnicas 1D y 2D. Así
mismo, los derivados fueron evaluados en la inhibición del crecimiento micelar de
B. cinerea presentando el pirocatecol prenilado mejores resultados que el
fungicida de baja toxicidad empleado como control.
Agradecimentos
• A la USM y UV por el financiamiento otorgado.
• Universidad Autónoma de Chile.
• Proyecto FONDECYT regular N°1201097, ANID.
Referências
• CASTRO, P., MENDOZA, L., VÁSQUEZ, C., PEREIRA, P. C., NAVARRO, F., LIZAMA, K., SANTANDER, R., & COTORAS, M. (2019). Antifungal Activity against Botrytis cinerea of 2,6-Dimethoxy-4-(phenylimino)cyclohexa-2,5-dienone Derivatives. Molecules, 24(4). https://doi.org/10.3390/molecules24040706.
• MULA, S., PATRO, B. S., KALENA, G. P., & CHATTOPADHYAY, S. (2006). Novel synthesis of prenylated phenols and their antioxidant properties. Natural Product Communications, 1(2), 131–137. https://doi.org/10.1177/1934578x0600100209.
• ROBLES-KELLY, C., RUBIO, J., THOMAS, M., SEDÁN, C., MARTINEZ, R., OLEA, A. F., CARRASCO, H., TABORGA, L., & SILVA-MORENO, E. (2017). Effect of drimenol and synthetic derivatives on growth and germination of Botrytis cinerea: Evaluation of possible mechanism of action. Pesticide Biochemistry and Physiology, 141, 50–56. https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2016.11.006.
• VASQUEZ-MONTAÑO, E., HOPPE, G., VEGA, A., OLIVARES-YAÑEZ, C., & CANESSA, P. (2020). Defects in the Ferroxidase That Participates in the Reductive Iron Assimilation System Results in Hypervirulence in Botrytis Cinerea. https://doi.org/10.1128/mBio.
• VERGARA, A. P., CONTRERAS, J. A., OSORIO, M. E., & CARVAJAL, M. A. (2015). Rapid method of Friedel-Crafts alkylation of phloroglucinol by microwave in dry media and reusable catalyst. Journal of the Chilean Chemical Society, 60(3), 3069–3073. https://doi.org/10.4067/S0717-97072015000300020.
