Autores
Michereff, M. (EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA) ; da Silva, S. (EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA) ; Borges, M. (EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA) ; Laumann, R. (EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA) ; Ribeiro, C.S.C. (EMBRAPA HORTALIÇAS) ; de Carvalho, S. (EMBRAPA HORTALIÇAS) ; Reifschneider, F. (EMBRAPA HORTALIÇAS) ; Blassioli Moraes, M. (EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA)
Resumo
O objetivo desse estudo foi identificar os compostos orgânicos voláteis produzidos
por três linhagens brasileiras de pimenta Capsicum chinense e a influência destes
compostos no seu odor. Para identificar os ésteres presentes nas pimentas estas
foram submetidas a aeração para a coleta dos voláteis e na sequência os extratos
obtidos foram submetidos a hidrólise alcalina. Todos os genótipos apresentaram
como componentes majoritários os ésteres 2-metilbutanoato e 3-metilbutanoatode 4-
metilpentila; o genótipo 15744 produziu os ésteres 2-metilbutanoato e 3-
metilbutanoato de 6-metil-(E)-4-heptenil em quantidades superiores comparado aos
outros dois genótipos. Os compostos 2-metilpropanoato e 3-metilbutanoato de (Z)-3-
hexenila estão relacionados com o odor das pimentas.
Palavras chaves
GC-nose; ésteres; odor
Introdução
As pimentas pertencentes ao gênero Capsicum possuem grande interesse comercial
devido às suas propriedades aromáticas e condimentares para uso na indústria
alimentícia. Vários estudos mostraram que ésteres com baixo peso molecular estão
envolvidos com a percepção do cheiro da pimenta (Bogusz et al., 2011, 2012;
Almeida 2015, Sganzerla 2015). Garruti e coautores (2021), trabalhando com uma
cultivar brasileira de pimenta tabasco BRS Avai (Capsicum frutescens), relataram
três compostos: 4-metilpentil 2-metilbutanoato, um composto não identificado e o
monoterpeno α-pineno como os compostos relacionados ao cheiro de pimenta. Três
linhagens de pimentas habanero (Siriema. Biquinho e CNPH 4080), esta última do
programa de melhoramento genético da Embrapa, apresentam 3-metilbutanoato de
hexila e 2-metilbutanoato de hexila como compostos majoritários e os autores
relacionaram esses dois compostos ao odor de pimenta e frutado (Garruti et al.,
2013). Alguns estudos relatam a importância das pirazinas para o aroma de C.
chinense; o olfato humano apresenta alta sensibilidade a essas moléculas (Pino
et al., 2006), como o composto 3-metóxipirazina de 2-isobutila identificado em
frutos verdes de pimenta habanero (C. chinense) (Pino et al., 2006). Os ésteres
identificados em todas as pimentas C. chinense apresentam a ramificação metil na
parte ácida no carbono 2 ou 3, enquanto a ramificação metil na parte alcoólica
do éster pode estar nos carbonos 2 a 6 (Pino et al., 2006, 2011, Garrutti et
al., 2012, 2021). Em termos de terpenos, diferentes variedades de C. chinense
apresentam uma série de sequiterpenos; os principais são: β-cariofileno, α e β-
himachalenos, β-farneseno e germarcreno D. Portanto, determinar quais compostos
estão envolvidos no odor das pimentas pode fornecer informações para mapear as
características organolépticas dessas frutas. A Embrapa Hortaliças está
desenvolvendo diferentes genótipos visando obter genótipos com resistência a
diversos vírus, como Oidiopsis sicula, e Meloidogyne javanica, como BRS Juruti,
e com frutos de alta qualidade, pungência e qualidade de odor para o mercado de
alimentos (Ribeiro et al., 2015). Assim, o objetivo deste trabalho foi
identificar os principais compostos voláteis presentes nas três novas linhagens
brasileiras do tipo habanero desenvolvidas pelo programa de melhoramento de
Capsicum da Embrapa (CNPH 15740, CNPH 15744, CNPH 15749) relacionados à sua
aromaticidade.
Material e métodos
As linhagens de habanero CNPH 15744, CNPH 15740 e CNPH 15749 (C. chinense),
originárias da população base CNPH 15469 foram cultivadas em casa de vegetação,
em Brasília, DF Brasil (coordenadas 48°08′34,2″ Sul; 15°55′ 59,8″ W; altitude
990 m), de janeiro a julho de 2019, sob condições edafoclimáticas do Cerrado
brasileiro, com faixa de temperatura média de 12,7 a 31,1 °C. Coleta de
voláteis dos frutos. Dois frutos de cada genótipo (CNPH 15744, CNPH 15740, CNPH
15749) foram cortados em quatro e imediatamente colocados em uma câmara de vidro
e os voláteis foram coletados por 2 horas. Os voláteis foram capturados em tubo
contendo adsorvente Porapak Q . Os tubos adsorventes foram eluídos com hexano
redestilado. As amostras foram analisadas por CG-DIC e CG-EM. Para auxiliar na
identificação da estrutura dos ésteres emitidos pelos frutos da pimenta, os
extratos foram submetidos à hidrólise; então através dos álcoois e ácidos
formados, combinados com os espectros de massa dos ésteres, pudemos propor os
ésteres presentes nos extratos. Os extratos de aeração da pimenta foram levados
a quase secura em fluxo de nitrogênio e os extratos foram submetidos à hidrólise
alcalina adicionando 1mL de metanol e 500 µL de NaOH 2M em um frasco cônico de
vidro de 1,5 ml e mantidos a 60oC por 1 hora. Após hidrólise, 1mL de HCl 1M foi
adicionado a cada amostra para atingir pH 3-4 e a fase orgânica foi extraída 3x
com 500 µL de éter dietílico. À fase orgânica foi adicionado NaHCO3 até parar de
formar CO2. O sal de ácido carboxílico formado foi extraído com água e a fase
orgânica contendo o álcool foi adicionado MgSO4, filtrado e concentrado até 100
µL para análise por GC-MS. À fase aquosa, contendo os sais de ácido carboxílico,
foi adicionado 1,0 mL de éter dietílico e HCL 1 M para atingir pH 5-6. Em
seguida, a fase orgânica com os ácidos carboxílicos foi extraída com 3x 1mL de
éter dietílico, seca com MgSO4, filtrada com tampão de lã de vidro em pipeta
Pasteur e analisada por GC-MS. Os voláteis coletados foram analisados por
cromatografia gasosa usando uma coluna de 60 m × 0,25 mm de diâmetro interno e
0,25 µm de espessura de filme (DB-5MS). A temperatura do forno foi mantida a
50°C por 2 min e programada de 5°C min-1 até atingir 180°C, depois 10°C min-1
até atingir 250°C e mantida por 20 min. O gás de arraste usado foi hélio. A
resposta ao odor a compostos voláteis dos extratos de frutas de C. chinense foi
avaliada por uma análise GC-olfatometria equipado com um detector de ionização
de chama (FID) e uma coluna DB-5MS (60 m x 0,32 mm i.d. 0,25 µm de espessura de
filme). A detecção do volátil por FID e por olfato humano ocorre
simultaneamente. Trinta juízes avaliaram o aroma das amostras voláteis coletadas
dos frutos do três genótipos, CNPH 15740, CNPH 15.744 e CNPH 15.749. Os juízes
respondem a detecção de odor usando uma escala de aromas, ou seja, frutado,
pimenta, ácido, rosa, floral e verde.
Resultado e discussão
A análise química dos voláteis da amostra de frutos de pimenta do tipo habanero
mostrou a presença de 50 compostos voláteis. Nas três linhas de habanero, os
ésteres 2-metilbutanoato 4-metilpentila e 3-metilbutanoato 4-metilpentila são os
majoritários (Fig. 1). A análise química da hidrólise básica dos extratos de
voláteis das amostras CNPH 15749, CNPH 15744 (Fig. 2 A) e CNPH 15740 mostrou a
presença dos ácidos 3-metilbutanoico e 2-metilbutanóico como majoritários, e
pequenas quantidades de ácidos 2-metilpropanóico, pentanóico, butanóico,
metilpropanóico, 4-metil-pentanóico e 8-metil-6-nonenóico (Fig. 2B). Os
principais álcoois identificados nas três linhas de habanero foram 4-metil-
penta-1-ol, (Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2 hexen-1-ol e hexanol (Fig 2C e 2D); os
compostos 6 metil 4-hepten-1-ol e 6-metil heptan-1-ol estavam presentes em
maiores quantidades apenas nas amostras de CNPH 15744 (Fig. 2D). Considerando
que o álcool 4-metil-1-pentanol e o ácido 3-metilbutanóico foram identificados
em grandes quantidades nas amostras submetidas a hidrólise alcalina, os
principais ésteres propostos foram 2-metilbutanoato de 4-metilpentila e 3-
metilbutanoato de 4-metilpentila (Fig. 1), e a identificação desses ésteres foi
confirmada com a injeção de padrões autênticos. Frutos do CNPH 15744 emitiram
maior quantidade de compostos KI = 1384 e KI = 1387, que foram atribuídos como
3,3 e 3,2 dimetilciclohexanol em estudos anteriores (Pino et al. 2006, 2011;
Garruti et al. 2000). No entanto, os espectros de massa destes compostos
apresentam um m/z 81 que não está presente nos espectros de massa da biblioteca
NIST e 3,2 dimetilciclohexanóis (Fig. 2 à esquerda). Além disso, quando os
extratos de CNPH 15744 foram submetidos à hidrólise alcalina esses picos
desapareceram, sugerindo que esses compostos são ésteres. O produto da hidrólise
alcalina do CNPH 15744 formou o álcool 6 metil- -hepten-1-ol, RI = 1019 e 6-
metil-heptan-1-ol RI = 1036, e o ácido majoritário o ácido 3-metilbutírico;
então sugerimos que esses picos são os ésteres 2-metilbutanoato de 6-metil-
(E)-4-heptenila e 3-metilbutanoato de 6-metil-(E)-4-heptenila (Fig. 2). Murakami
et al (2018) realizaram um estudo e confirmaram a presença desses ésteres nas
cultivares Red Savina e Orange Habanero (C. chinense). Os espectros de massa de
3-metilbutanoato e 2-metilbutanoato de 6-metil-(E)-4-heptenila relatados em
Murakami et al (2018) resolvem perfeitamente com os espectros de massa do pico
com KI = 1384 e KI = 1387 obtidos nesse trabalho.
Os juízes reconheceram como odor de pimenta em quatro compostos 2-
metilpropanoato de Z-3-hexenila, 2-metilpropanoato de hexila, e um forte odor de
pimenta foi identificado a partir do composto 2-metilbutanoato de Z-3-hexenila,
e de seu isômero (E), porém menos intenso.
Conclusões
Os resultados mostraram que os compostos majoritários identificados no perfil
químico das três variedades de pimentas, CNPH 15740, CNPH 15749 e CNPH 15744, não
estão relacionados ao odor da pimenta. A abordagem utilizada neste estudo
realizando a hidrólise básica da amostra contendo os componentes voláteis das
pimentas e posterior análise para identificar os álcoois e ácidos formados foi
essencial para a correta identificação dos ésteres presentes nas amostras. Estudos
futuros poderiam avaliar se outros genótipos e variedades de pimenta do C.
chinense apresentam esses componentes e sua influência no odor da pimenta.
Agradecimentos
Este trabalho recebeu apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal
(FAP-DF) e Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).
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