Autores
Diaz, C. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO) ; Cifuentes, D. (UNIVERSIDAD DE CONCEPCION) ; Oyarzun, M. (UNIVERSIDAD DE CONCEPCION) ; Jimenez, V. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO) ; Guzman, J.L. (UNIVERSIDAD DE CONCEPCION)
Resumo
En este trabajo se estudió el efecto de la modificación superficial de dendrímeros
poliamidoamina (PAMAM) sobre la internalización celular y la sinergia causada en los
fármacos antiproliferativos metotrexato (MTX) y octreótido (OCT). La funcionalización de
PAMAM se realizó utilizando dos moléculas modelo, diferentes en sus propiedades químicas
y su acción biológica: ácido fólico (FA) y polietilenglicol de 2000 Da (PEG). Se sustituyó con
cada molécula al 25 y 50% de la superficie, lo que se corroboró mediante 1H RMN, para
luego probar su efecto por si solos y combinados con OCT y MTX en distintas líneas
celulares. Resultó que los PAMAM modificados son altamente biocompatibles y potencian la
acción farmacológica de las drogas empleadas en dosis muy menores a las usadas
convencionalmente.
Palavras chaves
PAMAM; internalización celular; drug delivery
Introdução
La investigación en nanomateriales ha avanzado considerablemente en el dominio de la
arquitectura y propiedades químicas y biológicas de estas estructuras.(Aflori and Poni
2021; Mabrouk et al. 2021) Esta alza, ha fomentado el uso de los nanomateriales como
transportadores de distintas moléculas para diagnóstico y tratamiento de diversas
enfermedades de alta complejidad; como por ejemplo el cáncer. De los sistemas
nanotransportadores hasta hoy generados, los dendrímeros poliamidoamina (PAMAM),
han mostrado muy ser versátiles, sin embargo, aún es necesario realizar mejoras en ellos
para asegurar que no sean citotóxicos a pH fisiológico y a la vez, dar mayor selectividad
por tejido patológico.(Carola Diaz, Benitez, et al. 2018; Carola Diaz, Guzmán, et al. 2018;
Esfand and Tomalia 2001)
Por el lado de la patología a tratar, el cáncer es un desafío tanto en su diagnóstico como
en la terapia. Este problema subyace principalmente en los fármacos utilizados, los que
no son específicos por las células dañinas y en circulación alcanzan una pobre
biodisponibilidad por su baja solubilidad en sistemas acuosos. Es por ello que el uso de
moléculas, cuyo receptor se sobreexprese en algunos tipos de tumores, podría ser una
herramienta eficaz para hacer la quimioterapia más selectiva y también efectiva. En este
sentido, octreótido (OCT), análogo estructural de somatostatina, se perfila como un
antiproliferativo endógeno del organismo útil para este objetivo.(Markman et al. 2013)
Además, en su uso combinado con otra droga antiproliferativa como el metotrexato
(MTX),(Campos et al. 2016; Torres et al. 2016) podría potenciar su capacidad
antineoplásica, a pesar de su baja biodisponibilidad.
Con el objetivo de potenciar las características positivas de los PAMAM y emplearlos en
la terapia contra el cáncer, se modificaron superficialmente con polietilenglicol de 2000
Da (PEG) y con ácido fólico (FA) al 25 y 50% del total de aminas primarias disponibles
(PAMAM-PEG y PAMAM-FA), los que fueron caracterizados estructuralmente por
espectroscopía de resonancia magnética nuclear de 1H y además, se analizó su
citotoxicidad en cultivos celulares HEK, PC-12 y HeLa. Además, para conocer el efecto de
la funcionalización superficial en internalización celular, se marcaron con FITC y se
detectó el ingreso a las células a distintos tiempos mediante microscopía confocal.
Posteriormente, se formaron complejos supramoleculares con octreótido y metotrexato
–fármaco anticancerígeno convencional- para ver si los nanotransportadores eran
capaces de potenciar su efecto antiproliferativo intrínseco en distintos cultivos celulares.
Los resultados revelaron que la funcionalización de dendrímeros PAMAM de cuarta
generación modula la internalización celular. La pérdida de cargas positivas de PAMAM,
genera que sistemas modificados más allá del 25% provoca que los nanomateriales dejen
de ingresar a la célula. Por otro lado, el uso de PAMAM nativo y modificado, potencia el
efecto antiproliferativo que tienen octreótido y metotrexato a concentraciones
experimentales muy bajas. Tanto PAMAM-FA como PAMAM-PEG fomentan este
fenómeno tanto en cultivos celulares de HeLa como de PC12 mucho más que el
dendrímero sin funcionalizar, pero el sistema pegilado es el que alcanza un efecto más
pronunciado. Las concentraciones usadas, por debajo de la concentración terapéutica,
corroboran la sinergia entre ambas moléculas y a su vez, genera un efecto que solo se ve
al administrarlas con dendrímeros funcionalizados.
Material e métodos
SÍNTESIS PAMAM-FA: En un balón de reacción con 20 mL de buffer DMSO/HCO3- (1:1)
fue disuelto FA (0.12 mmol) y luego se añadieron (0.23 mmol), EDC (0.23 mmol) y TEA
(0.23 mmol), dejándolos bajo agitación a T° ambiente y atmósfera de nitrógeno durante
1h. PAMAM-G4 (7 µmol), se disolvió en 5 mL de DMSO y se agregó a la mezcla con el fin
de funcionalizar aproximadamente el 25% de las aminas primarias disponibles en su
superficie. La reacción transcurrió 24 horas bajo las mismas condiciones ya descritas. El
producto bruto fue purificado por diálisis en una membrana de 25 kDa contra agua, y
liofilizado. Se duplicaron las cantidades de reactivos para el sistema funcionalizado al
50% y todo el resto del procedimiento fue el mismo.
SÍNTESIS PAMAM-PEG: Se hizo reaccionar 3.6 mmol de polietilenglicol monometil éter
de 2000 Da en 200 mL de Tetrahidrofurano (THF). Posteriormente, se agregó a la mezcla
de reacción 7.2 mmol de 4-nitrofenil cloroformiato y 7.2 mmol de TEA, dejando
transcurrir la reacción a T° ambiente y agitación durante tres días. Obtenido el PEG
activado, PAMAM-G4, se funcionalizaron al 25% y 50%. Para ello se hizo reaccionar en
30 mL de DMSO el PAMAM-G4 (17 μmol) con PEG-4-NFC (0.6 mmol). Se duplicó esta
cantidad para el sistema modificado al 50%. La reacción transcurrió cinco días a T°
ambiente y agitación constante. Una vez finalizada la síntesis, el producto fue purificado
por ultrafiltración y liofilizado.
*Todos los dendrímeros obtenidos fueron caracterizados por 1H RMN y luego marcados
con FITC para los estudios de internalización celular.[9]
VIABILIDAD CELULAR: Se evaluó en cultivos de células HEK, PC-12 y HeLa. Las células
se incubaron en una placa de 96 pocillos en medio DMEM modificado, más diferentes
concentraciones (1.0, 10.0 y 100 µM) de PAMAM, PAMAM-FA y PAMAM-PEG (6
repeticiones de cada concentración,) por 24 h a 37°C y 5% CO2. Se retiró el
medio y se reemplazó por medio de cultivo con Alamar Blue. Se empleó DMEM como
control de supervivencia (C+), mientras que se empleó DMSO al 1,0% como control de
muerte (C-). La comparación con los grupos de control se realizó considerando p<0,05
para diferencias significativas. Los estudios con fármacos siguieron la misma
metodología, empleando una proporción de 1:1:1 de dendrímero respecto a MTX y OCT.
Todos los experimentos se realizaron en triplicado.[9]
INTERNALIZACIÓN CELULAR: Se evaluó en células HEK en placas de 24 pocillos
incubadas en medio DMEM modificado que contenía 0.5 µM de cada dendrímero
marcado con FITC a 1, 3 y 6 hrs. Pasado estos tiempos el medio fue removido y las
células fijadas con formaldehído al 4%. Se permeabilizaron con tritón al 1% y horse
serum al 10% en PBS durante 15 minutos, para luego marcar los nucleos de las células
con DAPI (300 nM) en medio de montaje. Finalmente, se analizó cada condición en el
microscopio confocal de alta resolución espacio-temporal SP8 lightning LEICA. Todos los
experimentos fueron por triplicado.[10]
Resultado e discussão
SÍNTESIS PAMAM MODIFICADOS: Con la finalidad de analizar el efecto de la
modificación superficial en PAMAM, se escogieron dos moléculas con propiedades
químicas distintas, para unirlas covalentemente al dendrímero a un 25 y 50% del total de
aminas primarias disponibles respectivamente. Primero se utilizó ácido fólico, una
molécula con carga aniónica y una zona hidrofóbica, que es un metabolito fundamental
en todas las células y su receptor se sobreeexpresa en células cancerígenas. Por otro lado,
se usó polietilenglicol de 2000 Da, un polímero altamente soluble en agua, polar sin
carga, usado desde hace décadas en el enmascaramiento de sustancias de uso
farmacológico para que no sean inmunogénicas en el organismo. Luego de la síntesis y
purificación, la caracterización por RMN mostró que la funcionalización fue al 25% y
41% con ácido fólico (PAMAM-FA 25 y PAMAM-FA 50), mientras que los dendrímeros
con PEG de 2000 Da resultaron al 30% y 50% (PAMAM-PEG 25 y PAMAM-PEG 50).
EFECTO DE LA MODIFICACIÓN SUPERFICIAL DE PAMAM SOBRE LA VIABILIDAD
CELULAR: Los dendrímeros funcionalizados, fueron probados para corroborar su
biocompatibilidad, en células HEK 293. Los estudios se realizaron a 24 h, para ver efecto
a exposición crónica. Los resultados, muestran que a las concentraciones analizadas (0.10
a 10 µmol/L), ninguno de los sistemas es citotóxico. Una leve tendencia sugiere que, a
mayor concentración hay mayor toxicidad, al igual que grados bajos de funcionalización
podrían ser menos biocompatibles a altas cantidades o tiempos más largos, resultados
que van en sintonía con la evidencia de otros trabajos previos. Con esta evidencia, se
comprueba que este es un rango óptimo para trabajar incluso con los sistemas más
citotóxicos, por lo cual no será un factor la exposición a los dendrímeros para los
experimentos siguientes.
INTERNALIZACIÓN CELULAR: Como modelo de estudio, se continuó usando la línea
celular HEK 293, para determinar el efecto del grado de funcionalización de los PAMAM
en su ingreso a las células. Los dendrímeros fueron marcados con FITC como sonda
fluorescente y se vio por microscopía confocal a distintos tiempos su ubicación en los
cultivos. Investigaciones previas demuestran que los sistemas con carga catiónica, son
internalizados a la célula mediante endocitosis, por lo que la modificación podría limitar
esta capacidad intrínseca de PAMAM nativo. En efecto, PAMAM sin modificar ingresa a
las células a todos los tiempos estudiados. Por otro lado, tanto en los sistemas PAMAM-
FA como PAMAM-PEG, solo los sistemas funcionalizados alrededor del 25% se vio
internalización. Para los dendrímeros al 50% de conjugación, ni siquiera a la exposición a
6 h mostró alguna variación. Estos resultados, ratifican la dependencia de la carga
positiva expuesta en la superficie de PAMAM con su mecanismo de ingreso a la célula,
pues mayor funcionalización implica mayor bloqueo de aminas primarias, las que
finalmente son las responsables de la carga catiónica del dendrímero a pH fisiológico.
ACCIÓN CITOTÓXICA DE COMPLEJOS DENDRÍMERO-OCT-MTX: Para indagar en el
efecto de los dendrímeros como nanotransportadores de fármacos, se probó su acción al
suministrarse con dos drogas antiproliferativas, octreótido (OCT) y metotrexato (MTX),
cada una por sí sola y también de forma conjunta. Todos los sistemas basados en PAMAM
generados, fueron expuestos en proporción 1:1 de dendrímero respecto a la droga y cada
molécula fue puesta a una concentración final en el pocillo de 1.0 µmol/L. Esta
concentración se escogió porque en el resultado anterior ningún PAMAM fue tóxico y se
encuentra por debajo de las cantidades que se suministran actualmente de OCT y MTX en
quimioterapia. Además, con los resultados de internalización celular, se usó PAMAM
nativo como modelo de dendrímero que entra a la célula, mientras que PAMAM-FA 50 y
PAMAM-PEG 50 como nanomateriales que no ingresan. Para esta etapa de estudio, se
analizaron los complejos farmacológicos en líneas celulares HeLa, HEK y PC12. En todos
los cultivos estudiados, los dendrímeros mostraron no tener efecto citotóxico
significativo, ratificando lo observado en experimentos anteriores. Análogamente, las
drogas octreótido y metotrexato, tampoco afectaron la viabilidad celular cuando fueron
incubadas por si solas o en mezcla sin presencia del nanomaterial. Sin embargo, al
incubarse las drogas por separado y conjuntamente, tanto para PAMAM-FA 50 como para
PAMAM-PEG 50, se observó que disminuyó significativamente la población celular con
respecto al control de viabilidad. De hecho, para la línea celular HeLa, resultó ser más
eficiente la sinergia con ambos dendrímeros y la mezcla de OCT y MTX; mientras que en
PC12 con MTX también hubo diferencias significativas en la población celular. En
contraste, cuando se utilizó células HEK, que, a diferencia de las anteriores, no proviene
de una línea de cáncer, el efecto observado no fue tan pronunciado. PAMAM sin
funcionalizar, por su parte, no fue efectivo potenciando el efecto antiproliferativo de las
drogas empleadas, excepto por un leve efecto con MTX en los cultivos de PC12. Con estos
resultados se ratifica que los dendrímeros tienen efecto sinérgico con los fármacos en las
líneas celulares estudiadas y a su vez, también observamos sinergia entre MTX y OCT
cuando los PAMAM modificados median la interacción.
Conclusões
Los dendrímeros funcionalizados basados en PAMAM de cuarta generación, fueron
exitosamente caracterizados con ácido fólico y polietilenglicol, alcanzando un grado de
conjugación del 25 y 41% con ácido fólico; mientras que con polietilenglicol resultó al
30 y 50%. Tanto PAMAM-FA como PAMAM-PEG demostraron ser biocompatibles, por lo
cual el porcentaje de funcionalización y el rango de concentraciones analizadas fue el
adecuado para el estudio.
Con respecto al análisis de los complejos con posible aplicación farmacológica, los
dendrímeros mostraron no ser citotóxicos en todas las líneas celulares estudiadas (HEK,
PC12 y HeLa). Por otro lado, ni metotrexato ni octreótido por si solos o en conjunto
mostraron efectos antiproliferativos.
PAMAM nativo no afectó la proliferación celular cuando fue aplicado en conjunto a las
drogas estudiadas. Análogamente, PAMAM-FA y PAMAM-PEG al interactuar con el
péptido y metotrexato, mostraron en las líneas celulares HeLa y PC12, disminuir
notablemente la población celular con respecto al control de viabilidad a pesar de la baja
concentración usada de los complejos. Por otra parte, el efecto en HEK fue menos
pronunciado con estos sistemas. También se observó sinergia entre OCT y MTX cuando
fueron suministrados en conjunto con los dendrímeros modificados, lo cual no ocurre
cuando se incuban sin nanotransportador. Este resultado es altamente auspicioso, sobre
todo considerando que ninguna molécula actuando por si sola demostró tener efecto
antiproliferativo.
Finalmente, con este estudio se concluye que PAMAM-FA y PAMAM-PEG, son capaces de
ser nanotransportadores biocompatibles para la terapia anticancerígena, potenciando el
efecto de fármacos antiproliferativos como octeótrido y metotrexato.
Agradecimentos
C. Díaz agradece el financiamiento al proyecto FONDECYT 3200546, V. Jiménez
al proyecto FONDECYT 1200204 y J.L. Guzmán al proyecto VRID 2021000249.
Referências
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Diaz, Carola, Carolina Benitez, et al. 2018. “Cytotoxicity and in Vivo Plasma Kinetic Behavior of Surface-Functionalized PAMAM Dendrimers.” Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 14(7): 2227–34.
Diaz, Carola, José Guzmán, Verónica A. Jiménez, and Joel B. Alderete. 2018. “Partially PEGylated PAMAM Dendrimers as Solubility Enhancers of Silybin.” Pharmaceutical Development and Technology 23(7): 689–96. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28368674 (October 22, 2018).
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