Autores
Martínez-medina, R.M. (UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CHACO AUSTRAL) ; Martínez-medina, J.J. (UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CHACO AUSTRAL) ; López-tévez, L.L. (UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CHACO AUSTRAL) ; Ferrer, E.G. (UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA) ; Williams, P.A.M. (UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA)
Resumo
La interacción de biometales con ligandos de interés biológico y/o farmacológico
generando complejos de coordinación puede potenciar la acción benéfica de dichos
compuestos. En nuestro grupo de trabajo, hemos sintetizado y caracterizado el
complejo de cobre con cianoguanidina y orto-fenantrolina (Cu/phen/cnge). Dicho
compuesto ha demostrado propiedades antimicrobianas frente a bacterias patógenas y
a levaduras. La potencial utilización de este complejo de síntesis como agente
farmacoterapéutico en el tratamiento de infecciones requiere del estudio
toxicológico correspondiente. Por ello, en el presente trabajo reportamos el
perfil de seguridad del complejo para mostrar su potencial como agente
antimicrobiano.
Palavras chaves
Complejo Cu/phen/cnge; perfil de seguridad; potencial antimicrobiano
Introdução
En publicaciones anteriores informamos la estructura molecular (difracción de
rayos X), biodisponibilidad y bioactividad del complejo de Cu(II) con
cianoguanidina (cnge) y fenantrolina (phen), [Cu(phen)(cnge)(H2O)
(NO3)2], Cu/phen/cnge (FERRER et al, 2007). Nuestro grupo
de investigación ha medido la acción antimicrobiana frente a bacterias patógenas
Gram-positivas y Gram-negativas y también frente a especies levaduriformes
mediante métodos de difusión en agar y dilución en agar que permite determinar
la concentración inhibitoria mínima (CIM) (MARTÍNEZ-MEDINA et al, 2014).
Complementando los estudios mencionados, hemos avanzado también en la
determinación del efecto posantibiótico y posantifúngico (mediante un método
espectrofotométrico), que pueden describirse como la fase de retraso o período
de recuperación del crecimiento bacteriano después de una breve exposición al
agente antimicrobiano a dosis del doble de la CIM durante 1 h a 37 °C (RESCOTT
et al, 1988). Los resultados de nuestras investigaciones sugieren que el
complejo Cu/phen/cnge es un buen candidato para el tratamiento de enfermedades
infecciosas dado que mostró propiedades antimicrobianas relevantes (con valores
de CIM menores a 100 µg/mL y efecto post-agente) frente a bacterias patógenas
como Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis y
frente a los hongos como Candida albicans, Candida tropicalis y Candida
parapsilosis. En este contexto se plantea la determinación de la toxicidad
aguda (Test de Artemia salina) y de la genotoxicidad (Test de Ames) del
complejo para evaluar su perfil de seguridad y mostrar su potencial uso como
agente farmacoterapéutico.
Material e métodos
El potencial mutagénico del complejo Cu/phen/cnge se evaluó mediante el método
de incorporación directa en placa (MARON & AMES, 1983). Se emplearon dos cepas
de Salmonella typhimurium (TA98 y TA100). Los repiques de las cepas se
cultivaron durante 12 a 14 horas a 37 °C en caldo Mueller Hinton. Las diferentes
concentraciones del complejo (hasta 187,5 µg/placa) se añadieron a 2 mL de
top agar fundido que posteriormente se mezclaron con 100 µL de cultivo
bacteriano y se vertió la mezcla sobre una placa conteniendo agar mínimo.
También se prepararon un set de placas sin complejo (y con solvente) que se
utilizó como control negativo. Estas placas se incubaron a 37 °C durante 48
horas y se realizó el recuento del número de colonias que se desarrollan
(revertantes). El índice mutagénico (IM) se calculó como el número medio de
revertantes por placa dividido por el número medio de revertantes espontáneas
(control negativo). Por otra parte, la toxicidad aguda del complejo se evaluó
empleando el crustáceo de mar Artemia salina. Los huevos de A.
salina se incubaron en una cámara con agua de mar artificial a 20-30 °C
(MEYER et al, 1982). Después de 24 horas, se tomaron 10 individuos (nauplios) y
se colocaron en sendos pocillos de policubeta en contacto con concentraciones
crecientes del complejo (hasta 750 µg/mL). Además se usó el solvente como
control negativo y el dicromato de potasio como control positivo. Los pocillos
conteniendo la muestra y 10 larvas del crustáceo (incluyendo los grupos
control), se llenaron con agua de mar artificial hasta un volumen total de 100
µL y fueron mantenidos durante 24 horas en contacto. Al término de este período,
se realizó el conteo de las larvas vivas (con movilidad) de cada pocillo.
Resultado e discussão
Los resultados del Test de Ames mostraron que a todas las concentraciones
ensayadas los valores de IM están por debajo de 1,5. Esto demuestra que el
complejo Cu/phen/cnge no induce mutaciones en las cepas TA98 y TA100 de
Salmonella typhimurium. Por lo tanto, el complejo no es capaz de inducir
mutaciones del tipo corrimiento de marco de lectura (S. typhimurium TA98)
o sustitución de pares de bases (S. typhimurium TA100) a las
concentraciones probadas. Cabe mencionar que este ensayo para detección de
sustancias capaces de inducir mutaciones está codificado en la Farmacopea
Nacional Argentina Séptima Edición por lo que es considerado un ensayo oficial.
Por otra parte, el modelo de toxicidad aguda en Artemia salina es útil
para la evaluación de nuevos fármacos con el fin de predecir su toxicidad y ha
mostrado una buena correlación con los ensayos en ratones, lo que sugiere que es
útil como modelo alternativo al uso de animales (LAGARTO-PARRA et al, 2001). En
el ensayo de A. salina, el complejo Cu/phen/cnge no indujo la muerte del
crustáceo de mar a concentraciones de hasta 750 µg/mL. Al no producirse la
muerte del crustáceo de mar no se pudo calcular la concentración letal media
(CL50) que ocasiona la muerte de la mitad de los individuos, pero
dicho parámetro debería situarse por encima de la mayor concentración ensayada.
Esto sugiere que el complejo no es tóxico a las concentraciones necesarias para
ejercer el efecto antimicrobiano. Previamente determinamos la mortalidad de los
nauplios producida por el ligando phen (CL50= 93,70 μg/mL) (MARTÍNEZ-
MEDINA et al, 2015). Estos resultados indican que la complejación disminuye la
toxicidad del ligando phen, mejorando la seguridad de este compuesto.
Conclusões
Los resultados de los estudios toxicológicos in vitro nos permiten concluir que el
complejo Cu/phen/cnge es un candidato prometedor para el desarrollo de un
medicamento para ser empleado en el tratamiento de enfermedades infecciosas. No
obstante, la actividad biológica y la seguridad representan sólo dos de los
numerosos aspectos relacionados al diseño de fármacos. Además, los estudios en
animales son necesarios en la etapa de investigación pre-clínica.
Agradecimentos
Esta investigación pudo realizarse gracias al apoyo económico de UNCAUS (PI N°
156), UNLP (X871), y ANPCyT (PICT 2019-945 y PICT 2019-3736).
Referências
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