Autores
Jara, G. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO, SEDE CONCEPCION) ; Saez, G. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO, SEDE CONCEPCION) ; Diaz, C. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO, SEDE CONCEPCION) ; Barraza, L.F. (UNIVERSIDAD ANDRES BELLO, SEDE CONCEPCION)
Resumo
En este trabajo se muestra la obtención de nanopartículas fotosensibilizadoras
(NP-PSs) por autoensamblaje molecular entre un dendrímero PAMAM de cuarta
generación (DG4) y Rosa de Bengala (RB). Las NP-PSs obtenidas fueron
caracterizadas por DLS y HR-TEM, encontrando una relación molar óptima DG4:RB de
1:20. En estas condiciones, se obtienen partículas esféricas de tamaño nanométrico
(280±35 nm), monodispersas (PdI=0,308±0,036), estables y con propiedades
fotoquímicas superiores respecto al colorante libre (RB), presentando un aumento
en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) de más del 50% luego de la
exitación con luz banca durante 30 minutos. Todas estas propiedades sugieren que
las NP-PSs obtenidas presentan gran potencial para ser aplicadas en terapia
fotodinámica.
Palavras chaves
NPs fotosensibilizadoras; Autoensamblaje molecular; Terapia fotodinámica
Introdução
La terapia fotodinámica (TFD) anticancerígena utiliza moléculas conocidas como
fotosensibilizadores (PSs) junto con la aplicación de luz de longitud de onda
específica para producir especies reactivas de oxígeno (ROS) las que ejercen
efectos citotóxicos sobre las células cancerosas (SZTANDERA et al 2020). Sin
embargo su aplicación clínica es restringida debido a características intrínsecas
de los PSs, como sus cortos tiempos de vida media, transporte transmembrana
limitado, agregación y extinción automática. En consecuencia, se requieren con
urgencia el desarrollo de nuevos sistemas transportadores de fármacos eficientes
que ayuden a superar estas limitaciones para que la aplicación clínica de la TDF
sea viable.
Para abordar esta problemática, en este trabajo se muestra la obtención y
caracterización fisicoquímica de una nueva familia de nanopartículas
fotosensibilizadoras (NP-PSs). Éstas NP-PSs fueron obtenidas mediante el método de
autoensamblaje molecular entre un dendrímero PAMAM de cuarta generación (DG4) y
Rosa de Bengala (RB), un colorante de xanteno aprobado por la FDA para el
tratamiento de varios tipos de cánceres y afecciones de la piel [DAMARTIS et all,
2021).
Material e métodos
Las nanopartículas fotosensibilizadoras (NP-PSs) se obtuvieron por el método de
auntoensambaje molecular en disolución acuosa (PBS a pH=7.4). Los bloques de
construcción de las NP-PSs fueron un dendrímero poliamidoamina (PAMAM-NH2) de
cuarta generación (DG4) y Rosa de Bengala (RB). La obtención de las NPs se
optimizó estudiando la dependencia de la relación molar DG4:RB con el tamaño de
las NP-PSs mediante experimentos de titulación por Dynamic Light Scattering (DLS).
Las NPs obtenidas fueron liofilizadas y caracterizadas en estado sólido por HR-TEM
y en disolución por DLS, NTA y medidas de potencial Z. Los parámetros de unión
termodinámicos entre DG4 y RB para la obtención de las NP-PSs en disolución acuosa
se evaluó mediante Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) con un calorímetro
Microcal PEAQ-ITC de Malvern Panalytical.
Por otro lado, se evaluaron las propiedades fotoquímicas de las NP-PSs obtenidas
midiendo la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) de los bloques de
construcción independientes (RB y DG4) y de la mezcla DG4-RB. La generación de
oxígeno singlete se detectó utilizando el reactivo Singlet Oxygen Sensor Green®
(SOSG), mientras que la generación de radicales hidroxilo se detectó utilizando el
reactivo de hidroxifenilfluoresceína (HPF), ambos disponibles comercialmente
(Thermo Fisher Scientific). Para ello, se añadieron 5 µL de una solución de SOSG o
HPF en metanol de 2 mmol L−1 a 100 µL de disoluciones de RB, DG4 y DG4-RB en una
placa de 96 pocillos. Los sistemas se irradiaron con una fuente de luz LED blanca
(100 W m−2) durante 30 min en intervalos de tiempo de 1 a 5 min. Todos los
experimentos se llevaron a cabo por triplicado utilizando utilizando un lector
multiplacas POLARstar OMEGA (BMG Labtech).
Resultado e discussão
Los experimentos de titulación por DLS mostraron que las propiedades morfológicas
y de superficie de las NPs obtenidas depende fuertemente de la relación molar
DG4:RB. Se encontró que la relación molar óptima DG4:RB es de 1:20, mientras que
un exceso de RB produce un aumento descontrolado del tamaño de las partículas, las
que finalmente colapsan y precipitan (Figura 1 a). En condiciones ideales, se
obtienen partículas de simetría esférica (Figura 1b), tamaño nanométrico (280 ± 35
nm), monodispersas (PdI=0,308±0,036) y con una carga superficial positiva
(6,48±1,96), levemente inferior a la del DG4 comercial (17,3±0,8). Por otro lado,
los parámetros de unión obtenidos por ITC dan cuenta que la formación de las NPs
se encuentra termodinámicamente favorecida (Kbin = 7,8 ± 1,8 E5 L/mol; ΔG = -8,04
kcal/mol) y que la interacción entre el dendrímero y el colorante es exotérmica
(ΔH= -7,38 ± 0,12 kcal/mol). Finalmente, en los ensayos de producción de ROS se
observó que las NPs (DG4:RB 1:20) presentaron propiedades fotoquímicas muy
superiores respecto al colorante libre (RB), es decir, se observó un aumento
superior al 100% tanto en la producción de oxígeno singulete, como en la
producción de hidroxilo radical luego de la excitación con luz blanca por un
período de 30 min (Figura 2), lo que es atribuible a un efecto fotoprotector
ejercido por DG4 sobre RB disminuyendo la autodegradación del colorante, el que en
estado libre pierde rápidamente la capacidad de producir ROS bajo irradiación en
las condiciones ensayadas.
a)Titulación de DG4 con RB. En exceso de RB (DG4:RB 1:30) las NP-PSs colapsan y precipitan. b) Microscopía HR-TEM de las NP-PSs en condiciones óptimas
Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por exitación con luz blanca. A) Producción de oxígeno singlete B) Producción de hidroxilo radical.
Conclusões
El método de ensamblaje molecular es una técnica rápida y eficiente para obtener
NP-PSs entre dendrímeros PAMAM y colorantes de xanteno como Rosa de Bengala (RB).
La estructura, y propiedades de estas NP-PSs dependen fuertemente de la relación
molar DG4:RB. En condiciones óptimas, se obtienen NPs monodispersas,
termodinámicamente estables en disolución acuosa y con propiedades fotoquímicas
mejoradas con respecto al colorante libre. Por lo tanto, las NP-PSs obtenidas
presentan propiedades que las convierten en potenciales candidatos para su
aplicación en terápia fotodinámica.
Agradecimentos
Los autores agradecen el financiamiento otorgado por el proyecto FONDECYT-ANID
11200611 y al proyecto FONDEQUIP EQM14116.
Referências
DAMARTIS,S; OBINU,A; GAVINI, E; GIUNCHEDI,P; RASSU, G. Nanotechnology-based rose Bengal: A broad-spectrum biomedical tool.Dyes and Pigments,188,2021.
SZTANDERA, K.; MARCIANKOWSKA, M.; GORZKIEWICZ, M.; JANASZEWSKA, A.; LAURENT, R.; ZABLOCKA, M.; MIGNANI, S.; MAJORAL, J. P.; KLANJNERTMACULEWICZ, B. In Search of a Phosphorus Dendrimer-Based Carrier of Rose Bengal: Tyramine Linker Limits Fluorescent and Phototoxic Properties of a Photosensitizer. Int. J. Mol. Sci. 21, 4456,2020.
