Bioimpresión 3D de constructos basados en una biotinta de polímeros naturales entrecruzados más óxido de grafeno como agente bioactivo

Autores

Olate-moya, F. (UNIVERSIDAD DE CHILE-IMPACT) ; Rubí-sans, G. (INSTITUTE FOR BIOENGINEERING OF CATALONIA (IBEC)) ; Mateos-timoneda, M. (BIOENGINEERING INSTITUTE OF TECHNOLOGY, UIC) ; Engel, E. (INSTITUTE FOR BIOENGINEERING OF CATALONIA (IBEC)) ; Palza, H. (UNIVERSIDAD DE CHILE-IMPACT)

Resumo

El uso de células madre mesenquimales humanas (hMSCs) en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa (ITMR) es una atractiva opción de tratamiento de enfermedades del cartílago. En este trabajo se desarrolla un nuevo biomaterial basado en alginato (ALG), gelatina (GEL), sulfato de condroitina (CS) y óxido de grafeno (GO) para aplicaciones en bioimpresión 3D. Los resultados muestran que el nanocompósito en combinación con hMSCs permiten fabricar constructos mediante bioimpresión 3D con alta fidelidad de forma y sobresaliente viabilidad celular a 28 días de cultivo in vitro. Además, este nanocompósito es intrínsecamente condrogénico sin utilizar factores exógenos. Los resultados de esta investigación muestran este biomaterial como candidato para aplicaciones en ITMR del cartílago.

Palavras chaves

Hidrogeles; Bioimpresión 3D; Condrogénesis

Introdução

Uno de los campos emergentes de mayor auge en las últimas décadas es la ITMR, en el cual mediante principios de ingeniería, química de los materiales y ciencias de la vida, se desarrollan sustitutos biológicos para restaurar, mantener o mejorar la función de un tejido u órgano entero (SHAFIEE; ATALA, 2016). En particular, el tejido cartilaginoso está compuesto por células llamadas condrocitos inmersas en una matriz extracelular (ECM) con pobre vascularización y carece de capacidad auto-regenerativa ante una lesión o degeneración (CALIKOGLU KOYUNCU et al., 2017). La ITMR se ha potenciado con el uso terapéutico de hMSCs, este fenotipo primitivo de células tiene la capacidad de diferenciarse a múltiples fenotipos celulares como por ejemplo condrocitos del cartílago (PAREKKADAN; MILWID, 2010). Hidrogeles basados en polímeros naturales como polisacáridos o polipéptidos poseen grupos funcionales modificables químicamente que permiten distintas opciones de entrecruzamiento, bioconjugación e injerto de motivos moleculares; lo que permite controlar las propiedades mecánicas, tasa de degradación, propiedades químicas y bioactividad del material (BALAKRISHNAN; BANERJEE, 2011). El propósito de este trabajo es producir una matriz de hidrogel reforzada con óxido de grafeno (GO) para imitar el ambiente extracelular del tejido cartilaginoso. Para obtener este nanocompósito hidrogel, se plantea bioconjugar el polisacárido alginato (ALG) con los polímeros bioactivos gelatina (GEL) y sulfato de condroitina (SC), para incrementar la adhesión-proliferación celular e inducir condrogénesis en células madre mesenquimales humanas (hMSCs), respectivamente. Para llevar a cabo la bioconjugación se modificó químicamente los biopolímeros con grupos metacriloílo (ALG-MA, GEL-MA y SC-MA) para obtener cadenas poliméricas foto-entrecruzables entre sí. A esta matriz de hidrogel se adicionó GO y hMSCs para formular una biotinta apta para la fabricación de constructos mediante bioimpresión 3D.

Material e métodos

Los tres biopolímeros ALG, SC y GEL fueron funcionalizados con grupos metacriloilo polimerizables, para obtener respectivamente ALG-MA, SC-MA y GEL-MA (OLATE-MOYA et al., 2020). Los biopolímeros metacrilados fueron caracterizados mediante resonancia magnética nuclear de protones (¹H RMN). El foto- entrecruzamiento de los biopolímeros metacrilados, fue llevado a cabo utilizando el fotoiniciador (PI) Irgacure 2959 al 0.05 % (p/v). La síntesis de GO fue realizada mediante el método de Hummers modificado, a partir de la oxidación de grafito en polvo (XIN et al., 2015). El GO sintetizado fue caracterizado a través de FTIR, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y difracción de rayos X (DRX). La bioimpresión 3D de constructos se realizó empleando una biotinta compuesta por: ALG 17 mg mL^-1, ALG-MA 10 mg mL^-1, CS-MA 10 mg mL^-1, GEL-MA 10 mg mL^-1, GO 0.1 mg mL^-1, PI 0.5 mg mL^-1 y 8.4 · 10⁵ hMSCs mL^-1 en buffer fosfato salino (PBS) con 10 % de suero fetal bovino (FBS). Los constructos fueron fabricados en una bioimpresora 3DDiscovery^TM Evolution (RegenHu), equipada con una lámpara LED UV. La viabilidad de las hADMSCs embebidas en los constructos fue estudiada in vitro mediante un ensayo de doble tinción Live/Dead utilizando calceína-AM y ioduro de propidio. Para determinar los niveles de expresión de genes condrogénicos, se llevó a cabo un análisis cuantitativo mediante reacción en cadena de polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-qPCR). Se estudió la expresión génica de colágeno tipo I (COLL I), colágeno tipo II (COLL II), agrecano (ACAN) y SOX 9.

Resultado e discussão

El análisis mediante espectroscopía ¹H RMN confirmó la funcionalización de los tres biopolímeros (Figura 1a). Los espectros de ALG-MA y SC-MA exhiben los dobletes característicos de protones vinílicos a 5.75 y 6.14 ppm, multipletes de protones metilénicos a 3.39 y 3.55 ppm y singletes de protones metílicos a 1.94 ppm; correspondientes a las funcionalidades de metacrilato de 2-amidoetilo. El espectro ¹H RMN de GEL-MA muestra picos de protones vinílicos de grupos metacrilamida a 5.44 y 5.67 ppm, un doblete adicional de protones vinílicos a 5.75 y 6.14 ppm correspondiente a grupos metacrilato y el singlete de protones metílicos a 1.94 ppm. La síntesis de GO verificó mediante ATR-FTIR, DRX y TEM (Figura 1b). El espectrograma ATR- FTIR exhibe las bandas de estiramiento típicas de grupos funcionales oxidados: banda ancha de enlaces O-H en torno a 3200 cm^-1, carbonilos a 1712 cm^-1, enlaces dobles C=C del plano basal aromático a 1618 cm^-1 y de enlaces C-O a 1040 cm^-1. Al comparar los patrones de DRX de grafito y GO, se demuestra que la oxidación y el proceso de exfoliación durante la síntesis produce un incremento de la distancia entre capas (d). Mientras el grafito presenta una intensa reflexión característica a 26.38 ° (2θ, d = 0.34 nm), el difractograma de GO exhibe un pico de baja intensidad a 12.37 ° (2θ, d= 0.71 nm) correspondiente a las reflexiones del plano 001 producido por pocas capas de GO. Las imágenes TEM ratifican la morfología laminar 2D del GO obtenido. La base de la biotinta empleada es alginato que permite mejor procesabilidad durante la bioimpresión además de aportar densidad de cargas negativas característico de la ECM del cartílago, bioconjugado con gelatina (homólogo al colágeno del cartílago) y sulfato de condroitina (presente naturalmente en la ECM del cartílago), en compósito con óxido de grafeno (aporta densidad de cargas negativas y mejora la calidad de impresión). Los ensayos Live/Dead realizados a los constructos 3D bioimpresos con la biotinta formulada mostraron una elevada viabilidad celular (cerca de un 100 %) hasta el día 21 de cultivo y una distribución celular homogénea, tal como se muestra en la Figura 2a. El ensanchamiento de las hebras bioimpresas puede atribuirse a la producción de ECM, así como al hinchamiento del hidrogel. Para cuantificar las propiedades condroinductivas del biomaterial desarrollado, se estudió la expresión génica de marcadores condrogénicos mediante RT-qPCR en las células cultivadas en los constructos utilizando medio no-condrogénico. La Figura 2b muestra el cambio en la proporción (fold-change) de la expresión genética de los marcadores indicativos de condrogénesis COLL 2, SOX 9 y ACAN al día 14, 28 y 45 post bioimpresión (COLL 1 como control negativo). Pasado 14 días de cultivo de los constructos, ya se expresaron positivamente los tres marcadores condrogénicos y se tuvo un máximo de expresión relativa en el día 28. Estos resultados replican el periodo que usualmente tarda el proceso de diferenciación condrogénica cuando se utilizan medios de cultivos con suplementos bioquímicos condrogénicos, lo que convierte este nuevo biomaterial en un medio intrínsecamente condroinductivo.

Espectros 1H RMN de los biopolímeros metacrilados (a). GO sintetizado: espectro ATR-FTIR y patrón de DRX con imagen TEM inserta (b).


Ensayo Live/Dead en constructos 3D bioimpresos (barra: 600 μm) (a). Expresión génica de marcadores condrogénicos (*: p<0.05, **: p<0.01) (b).

Conclusões

La metacrilación de los polímeros utilizados es una estrategia sencilla de modificación química que permite la bioconjugación mediante foto-entrecruzamiento, lo cual fue implementado en un proceso de bioimpresión 3D. La biotinta formulada es apta para la bioimpresión 3D de constructos con elevada viabilidad celular y calidad de impresión. La matriz de alginato bioconjugado más GO es intrínsecamente condroinductiva en hMSCs. Estos resultados son muy relevantes, puesto que el desarrollo de biomateriales intrínsecamente condroinductivos ha sido muy poco reportado.

Agradecimentos

Los autores agradecen a CONICYT Beca de Doctorado Nacional N° 21150039, Proyecto FONDECYT N° 1150130 y Proyecto ANID-Basal Center of Interventional Medicine for Precision and Advanced Cellular Therapy, IMPACT, # FB210024.

Referências

BALAKRISHNAN, B.; BANERJEE, R. Biopolymer-based hydrogels for cartilage tissue engineering. Chemical reviews, v. 111, n. 8, p. 4453–74, 10 ago. 2011.
CALIKOGLU KOYUNCU, A. C. et al. Cartilage tissue engineering on macroporous scaffolds using human tooth germ stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, v. 11, n. 3, p. 765–777, 1 mar. 2017.
OLATE-MOYA, F. et al. Chondroinductive Alginate-Based Hydrogels Having Graphene Oxide for 3D Printed Scaffold Fabrication. ACS Applied Materials & Interfaces, v. 12, n. 4, p. 4343–4357, 29 jan. 2020.
PAREKKADAN, B.; MILWID, J. M. Mesenchymal Stem Cells as Therapeutics. Annual Review of Biomedical Engineering, v. 12, n. 1, p. 87–117, 2010.
SHAFIEE, A.; ATALA, A. Tissue Engineering: Toward a New Era of Medicine. Annual Review of Medicine, v. 68, n. 1, p. 29–40, 2016.
XIN, G. et al. Highly thermally conductive and mechanically strong graphene fibers. Science (New York, N.Y.), v. 349, n. 6252, p. 1083–7, 4 set. 2015.